Page 22 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第2期
·168 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年2月
ROS的影响。HCASMC 在5 mmon/L糖浓度(NG组, (S473)蛋白表达进行比较,P < 0.05 为差异有统计
n=3)、15 mmon/L糖浓度(HG组,n=3)、15 mmon/L糖 学意义。
浓度+GKT137831(HG+GKT组,n=3)孵育48 h后,用
2 结 果
PBS洗涤2次,然后加入DCFHDA 10 μL和90 μL无
血清 SMBM 培养基 37 ℃培养 30 min,孵育后用 PBS 2.1 不同糖浓度下HCASMC中BK⁃α、BK⁃β1、DNA⁃
洗涤 2 次,荧光显微镜 480~525 nm检测DCF荧光强 Pkcs、Akt、p⁃Akt的表达
度。快速冰冻的大鼠冠状动脉血管环被切割成30 μm 与 5 mmol/L 葡萄糖浓度下的 HCASMC 比较,
厚的切片,并放置在玻璃玻片上(DM,n=3;DM+GKT, 15 mmol/L葡萄糖浓度下HCASMC中BK⁃α表达无明
n=3)。DCFH⁃DA(25 μmon/L)应用于组织切片,37 ℃ 显变化,BK⁃β1 蛋白表达降低(P < 0.05),DNA⁃
避光孵育30 min,荧光显微镜480~525 nm 检测DCF Pkcs、Akt、p⁃Akt的表达增高(P < 0.05,图1)。
荧光强度,将使用Scion Image软件对DCF信号进行 2.2 Wortmannin 处 理 HCASMC 后 BK ⁃ β1、DNA ⁃
进一步的密度分析。 Pkcs、Akt、p⁃Akt的表达
1.2.4 采用蛋白免疫印迹(Western blot)检测HCASMC HCASMC 以 Wortmannin(100 nmol/L)预 处 理
及大鼠冠状动脉BK⁃a亚基、BK⁃β1亚基、DNA⁃Pkcs、 30 min后,在15 mmol/L葡萄糖浓度的SMBM中培养
Akt、p⁃Akt(S473)表达 48 h 并和对照组相比较,Wortmannin 处理组,DNA⁃
等量蛋白分别行8%~12%丙烯酰胺凝胶电泳, Pkcs、Akt 的表达无明显变化(P > 0.05),p⁃Akt 蛋白
5%脱脂牛奶室温封闭1 h,一抗4 ℃封闭过夜,洗膜, 表达量明显降低,BK⁃β1 的表达量明显增高(P <
HRP标记二抗室温封闭2 h。洗膜后再用GAPDH抗 0.05,图2)。
血清封闭,ECL试剂盒发光,吸光度分析法定量。 2.3 GKT137831 作 用 于 15 mmol/L 糖 浓 度 下 的
1.3 统计学方法 HCASMC 48 h后BK⁃β1、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt的表达
以SPSS 11.5统计分析软件进行分析,计量资料 与15mmol/L糖浓度下的HCASMC比较,15mmol/L
以均数士标准差(x ± s)表示。采用 t 检验对正常组 糖浓度下HCASMC经GKT137831处理48 h后,DNA
和糖尿病组 BK⁃a、BK⁃β1、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt ⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt蛋白表达降低(P < 0.05),BK⁃β1表
NG HG NG HG NG
DNA⁃Pkcs 460 kDa Akt 56 kDa 1.0 HG
BK⁃α 125 kDa p⁃Akt 56 kDa 蛋白相对表达量 1.2
0.8
28 kDa GAPDH 36 kDa 0.6 * * *
BK⁃β1 0.4 *
GAPDH 36 kDa 0.2
0.0
BK⁃α BK⁃β1 DNA⁃Pkcs Akt p⁃Akt
NG:5 mmol/L葡萄糖浓度;HG:15 mmol/L糖浓度,与NG组比较,P < 0.05(n=3)。
*
图1 Western blot检测不同葡萄糖浓度下HCASMC中BK⁃α、BK⁃β1、DNA⁃PKcs、Akt、p⁃Akt(S473)的表达
Figure 1 Expression of BK⁃α,BK⁃β1,DNA⁃PKcs,Akt and p⁃Akt(S473)of human coronary artery smooth muscle cells in
different glucose concentrations by Western blot
Wort(-) Wort(+) Wort(-) Wort(+) 2.0 Wort(-)
蛋白相对表达量 1.0
DNA⁃Pkcs 460 kDa Akt 56 kDa 1.5 Wort(+)
28 kDa *
BK⁃β1 p⁃Akt 56 kDa
GAPDH 36 kDa GAPDH 36 kDa 0.5 *
0.0
BK⁃β1 DNA⁃Pkcs Akt p⁃Akt
Wortmanin预处理HCASMC 30 min后在15 mmol/L糖浓度下培养48 h,与正常对照组比较,P < 0.05(n=3)。
*
图2 Western blot检测Wortmannin作用于HCASMC后BK⁃β1、DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt(S473)的表达
Figure 2 Expression of BK⁃β1,DNA⁃Pkcs,Akt and p⁃Akt(S473)of human coronary artery smooth muscle cells treated
with Wortmannin by Western blot