Page 21 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 21

第42卷第2期       焦国庆，李明秋，吴 莹，等. PI3K/Akt调控糖尿病冠状动脉平滑肌细胞BK通道的作用机制［J］.
                  2022年2月                   南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（02）：166-170，199                     ·167 ·


                    糖尿病严重危害人类健康，往往合并心、脑、                          防治研究所动物中心），体质量（200±30）g。本研究方
                肾、视网膜等脏器和组织的并发症，其中以冠状动                            案经南京医科大学实验动物伦理委员会批准，实验
                脉病变尤为严重，可导致心肌梗死、恶性心律失常                            动物的使用和喂养遵循ARVO声明。
                和心脏猝死等严重并发症，已成为我国急性心肌梗                            1.2  方法
                                       ［1］
                死的最主要危险因素之一 。大电导钙激活钾通道                            1.2.1 HCASMC的处理
               （BK通道）广泛分布于冠状动脉平滑肌细胞上，由4个                              HCASMC 培养于 SMBM 培养基，正常糖浓度培
                α亚基和4个β亚基组成，其中α亚基形成BK通道的                          养基及高糖浓度培养基葡萄糖浓度分别为5 mmon/L
                孔区，β亚基为辅助亚基，对 BK 通道动力学起重要                         及 15 mmon/L。PI3K抑制剂Wortmannin处理组以不
                调节作用。在血管平滑肌细胞上，主要为β1 亚基，                          含血清的SMBM培养基加入Wortmannin（100 nmon/L）
                参与血管张力调节，对冠状动脉血管舒张收缩功能                            预处理细胞 30 min，再以高糖浓度培养基培养 48 h
                起重要调节作用        ［2-3］ 。高血糖可上调超氧化物歧化               （n=3），对照组以终浓度 0.1%（w/w）的二甲基亚砜
                酶（superoxide dismutase，SOD）的水平，SOD 抑制过           （DMSO）的无血清培养基预处理细胞30 min，再以高糖

                氧化氢酶表达，导致细胞内活性氧（reactive oxygen                   浓度培养基培养48 h（n=3）。ROS抑制剂GKT137831
                species，ROS）显著增加，糖尿病患者体内 ROS 增高                   处理组以GKT137831（20 μmon/L）加入高糖浓度培
                是糖尿病患者的普遍特征。ROS 是BK 通道的强力                         养的 HCASMC 作用 48 h（n=3），对照组以终浓度
                抑制剂，使BK通道的生理功能障碍，本课题组以前                           0.1%（w/w）的二甲基亚砜（DMSO）作用于高糖浓度
                的研究证实，在糖尿病合并冠心病患者的冠状动脉                            培养的人平滑肌细胞（n=3）。用预冷的磷酸盐缓冲
                                                        ［4］
                平滑肌细胞中BK⁃β1降低，BK通道功能障碍 。最                         液冲洗细胞 3 次，加入 RIPA 裂解液，在冰上充分裂
                近的研究表明，细胞氧化应激反应的核因子E2相关                           解，离心后收集上清液，采用二喹啉甲酸法测定蛋
                因子 2（Nrf2 ）可能参与 BK 通道的调节，并可能与 E3                  白浓度。
                泛素连接酶引起的 BK⁃β1 的分解代谢加快，BK⁃β1                      1.2.2 糖尿病大鼠动物模型的建立及处理
                降低有关    ［5-6］ 。                                       20 只大鼠采用 STZ 60 mg/kg 腹腔内注射，2 周
                    DNA 依赖的蛋白激酶催化亚单位（DNA⁃Pkcs）                    后测定大鼠血糖浓度，如血糖浓度低于 300 mg/dL，
                属于磷脂酰肌醇⁃3⁃激酶（PI3K）超家族，与蛋白激酶                       则用等剂量 STZ 再次腹腔内注射，持续 8 周血糖浓
                B（Akt）的 473 丝氨酸（S473）的磷酸化（p⁃Akt）有                 度高于 300 mg/dL 诊断为糖尿病。10 只大鼠腹腔
                关 ［7］ 。以前的研究表明，ROS 能激活细胞内 DNA⁃                    内注射生理盐水作为正常对照组（Nor，n=10）。20只
                Pkcs 和 PI3K/Akt 信号传导通路，调节细胞的生长、                   糖尿病大鼠中，10 只以 GKT137831［40 mg/（kg·d）］
                分化及细胞凋亡        ［8-9］ 。本研究探讨糖尿病中 PI3K/             灌胃 2周（DM+GKT，n=10），10只糖尿病大鼠灌胃相
                Akt信号传导通路是否参与冠状动脉平滑肌细胞中                           同数量的饮用水 2 周（DM，n=10），处死大鼠。分离正
                BK⁃β1的调节。                                         常大鼠、糖尿病大鼠及经GKT137831灌胃的糖尿病
                                                                  大鼠冠状动脉，冠状动脉分离方法在课题组相关文
                1  材料和方法
                                                                              ［6］
                                                                  献中已有详述 。简言之，处死的大鼠酒精消毒后，
                1.1  材料                                           切开大鼠胸腔，将大鼠心脏连同出入心脏的大血管切
                    人冠状动脉平滑肌细胞（human coronary ar⁃                 下，将切下的心血管组织浸入冰冷的缓冲液中
                tery smooth muscle cell，HCASMC，中科院上海细胞           （NaCl 145 mmol/L、KCl 4.0 mmol/L、CaCl20.05 mmol/L、

                研究所），HCASMC 培养基 SMBM（Lonza Walkers⁃               MgCl2 1.0 mmol/L 、HEPES 10 mmol/L 、Glucose
                ville 公司，美国），ROS 检测试剂盒、二甲基亚砜                      10 mmol/L，pH7.20），在外科手术显微镜下使用显微
               （DMSO）、PI3K 抑制剂 Wortmannin（上海碧云天公                  手术器械，自大鼠主动脉根部冠状动脉起始部，沿左
                司），ROS 抑制剂 GKT137831（SELLECK 公司，美                 侧及右侧冠状动脉走行途径，细微分离右冠状动脉及
                国）。链脲佐菌素（streptozocin，STZ）（Sigma公司，美              左冠状动脉。冠状动脉血管组织用液氮速冻后储存

                国）。抗BK⁃a抗体（Alomona公司，以色列），抗BK⁃β                   于-80 ℃备用。将动脉组织匀浆化，收集总蛋白。
                1 抗体（Abcam 公司，美国），DNA⁃Pkcs、Akt、p⁃Akt              1.2.3 HCASMC及糖尿病大鼠冠状动脉中ROS检测
               （S473）（Santa Cruz 公 司 ，美 国）。 SPF 级 Spraque             用细胞渗透荧光探针DCFHDA检测人HCASMC
                Dawley 8~12周龄的雄性大鼠30只（江苏省血吸虫病                     及糖尿病大鼠冠状动脉中的 ROS 及 GKT137831 对
   16   17   18   19   20   21   22   23   24   25   26