Page 16 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第2期
               ·162 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年2月


              H1299 细胞 48 h，实验分组为：①pcDNA3.1 组；②                           BEAS⁃2B  A549  PC9   H1299
              pcDNA3.1/p300 组。收集细胞蛋白行 Western blot                  IL⁃17RA                          —96 kDa
              检查。
                  同样，将 shp300 小干扰质粒转染细胞 48 h，之                       β⁃actin                         —42 kDa
              后用 IL⁃17 刺激 3 h。实验分组为：①shCTR+IL⁃17                 图1  IL⁃17RA在支气管上皮细胞（BEAS⁃2B）和NSCLC 细
              组；②shp300⁃1+IL⁃17 组；③shp300⁃2+IL⁃17 组；④                胞系（A549、PC9和H1299）中的表达
              shp300⁃3+IL⁃17组。收集细胞蛋白行Westernblot检查。              Figure 1  The expression of IL⁃17RA in bronchi epithelial

              1.2.5.2  过表达或沉默 p300 对 H1299 细胞迁移和                         cell（BEAS⁃2B）and NSCLC cell line（A549，PC9
                                                                         and H1299）
              侵袭的影响
                  实验分为：①pcDNA3.1 组；②pcDNA3.1/p300               达。IL⁃17 刺激后 2 h，p300 和 MMP2 的表达显著升
              组；③shCTR+IL⁃17组；④shp300+IL⁃17组。 检查时               高，3 h 时达到高峰（图 3）。因此，后续选择了 IL⁃17
              间点为0 h和24 h。具体方法同前。                               刺激细胞3 h作为蛋白检测的时间点。

              1.2.5.3  过表达或沉默 p300 影响 H1299 细胞表达                2.4  敲低 IL⁃17RA 表达对 IL⁃17 诱导的 H1299 细胞
              MMP2的测定                                           p300和MMP2表达的影响

                  过表达 p300 的分组为：①pcDNA3.1 组；②pcD⁃                    为了明确 p300 和 MMP2 蛋白的表达确为 IL⁃17
              NA3.1/p300 组。沉默 p300 的分组为：①shCTR 组；               刺激及IL⁃17结合IL⁃17RA所致，将H1299细胞转染
              ②shCTR+IL⁃17 组；③shp300+IL⁃17 组。用 Western          siIL⁃17RA 48 h 再用 IL⁃17 刺激 3 h。结果显示，IL⁃
              blot检查MMP2的表达，时间点选择见前所述。                          17刺激细胞后3 h能显著上调p300和MMP2的蛋白
              1.3  统计学方法                                        表达，而siIL⁃17RA+IL⁃17组p300和MMP2的蛋白水
                  所有实验均独立重复3次，数据以均数±标准差                         平则显著减少（图4）。
             （x ± s）表示。采用 SPSS 19.0 统计软件进行统计学                   2.5  过表达或敲低 p300 对 H1299 细胞迁移、侵袭
              分析，多组间比较则采用单因素方差分析，Bonfferoni                     及表达MMP2的影响
              法进行两两比较，P < 0.05为差异有统计学意义。                        2.5.1  p300 过表达和 shp300 质粒验证及 shp300 有
                                                                效沉默靶点的确定
              2  结 果
                                                                     将pcDNA3.1/p300过表达质粒和对照质粒分别
              2.1  NSCLC细胞系IL⁃17RA的表达                           转染 H1299 细胞 48 h（转染效率约 70%），收集细胞
                  为了证实 NSCLC 细胞表面存在 IL⁃17RA，检测                  蛋白检测 p300 的表达。结果显示，转染 pcDNA3.1/
              了正常支气管上皮细胞 BEAS⁃2B 及 NSCLC 的 3 种                  p300的细胞中，p300的表达显著增加（图5）。
              细胞系（A549、PC9和H1299）。结果显示，这些细胞                          将构建的 3 个针对不同靶点的 shRNAp300⁃1、
              均有IL⁃17RA 的表达，但NSCLC 细胞系表达更为明                     shRNAp300⁃2、shRNAp300⁃3 质粒和其对照 shCTR
              显，尤以 H1299 细胞显著（图 1），故后续选择 H1299                  质粒分别转染 H1299 细胞 48 h 发现，shp300⁃2 能显
              细胞系开展实验。                                          著下调 p300 蛋白的表达（图 5），故后续选取了

              2.2  敲低 IL⁃17RA 对 IL⁃17 诱导的 H1299 细胞迁移            shp300⁃2进行实验，并统一简化命名为shp300。
              和侵袭的影响                                            2.5.2  过表达或敲低 p300 对 H1299 细胞迁移和侵
                  为了确定 IL⁃17 可通过结合 IL⁃17RA 来影响                  袭的影响
              H1299 细胞的迁移和侵袭，在转染了 siIL⁃17RA 的                        为了检查 p300 基因对 H1299 细胞迁移和侵
              H1299细胞中进行划痕和Transwell实验。结果发现，                    袭的影响，在细胞转染 p300 表达质粒和 shp300 质
              转染siIL⁃17RA质粒48 h后再用IL⁃17（50 ng/mL）刺              粒后进行了划痕和侵袭实验。结果表明，转染
              激24 h，siIL⁃17RA+IL⁃17组的细胞迁移和侵袭能力                  pcDNA3.1/p300 质粒可增加细胞的迁移和侵袭能
              均明显降低（图2）。                                        力，而转染shp300质粒48 h后再行IL⁃17刺激24 h，

              2.3  IL⁃17 刺激 H1299 细胞不同时间 p300 和 MMP2            其迁移和侵袭能力均明显降低（图6）。
              蛋白表达的变化                                           2.5.3  过表达或沉默 p300 基因对 H1299 细胞表达
                  用前述剂量的IL⁃17刺激H1299细胞0、1、2、3、                  MMP2的影响
              6、12 h，采用Western blot 检测p300和MMP2蛋白表                   细胞转染质粒同前。Western blot 检测结果显
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