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第42卷第2期      李 雅，葛     文，张志伟，等. IL⁃17诱导的p300调控NSCLC细胞迁移、侵袭和MMP2表达的作用［J］.
                  2022年2月                     南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（02）：160-165                       ·161 ·


                    肺癌是人类常见的恶性肿瘤，病理上分为小细                          1.2  方法
                胞肺癌和非小细胞肺癌（non⁃small cell lung cancer，            1.2.1  BEAS⁃2B、A549、PC9和H1299细胞系的培养
                NSCLC）两大类，后者约占临床病例的 85%               ［1-2］ 。由    及IL⁃17RA的检测
                于NSCLC发病率高，患者死亡又多与瘤细胞的侵袭                              将细胞接种于 DMEM 完全培养液（10%胎牛血
                转移有关，故研究NSCLC的转移机制极为重要。                           清）中，置于37 ℃、5%CO2孵箱中培养48 h 。当细胞
                    NSCLC 发生发展与多种因素密切相关。近年                        融合度达到90%时，按1∶5比例进行传代培养。
                来，关于肺部慢性炎症诱发NSCLC的文献日趋增多，                             Western blot 实验：细胞裂解物离心 3 min 取
                其机制不仅涉及肿瘤局部促炎因子的表达上调 ，而                           30 μg 蛋白行 SDS⁃PAGE 电泳。电泳 2 h 再湿转
                                                         ［3］
                且某些因子还能诱导瘤细胞的侵袭和转移                    ［4-5］ 。已    120 min。待蛋白转印到 PVDF 后用脱脂牛奶封闭
                知 IL⁃17 是一种典型的促炎因子，其在多种肿瘤组                        2 h，加IL⁃17RA一抗4 ℃过夜。用HRP 标记的二抗
                织中的表达常显著上调           ［4-5］ 。本课题组以往的研究             孵育1 h。最后行ECL化学发光试剂测定。

                表明，在 NSCLC 的癌组织内 IL⁃17 及 IL⁃17 受体（IL⁃             1.2.2  沉默IL⁃17RA基因后检测H1299细胞迁移和
                17RA）的表达明显升高。体外用 IL⁃17 刺激 NSCLC                   侵袭能力
                                                ［6］
                细胞后也能诱导其增生、迁移与侵袭 。不过，其诱                               培养 H1299 细胞，待其生长融合度达 80%时进
                导细胞迁移与侵袭的分子机制并不清楚。                                行siIL⁃17RA质粒的转染。先用DMEM对4 μL lipo⁃
                    基 质 金 属 蛋 白 酶（matrix metalloproteinase，       fectamine 2000和2000 ng siIL⁃17RA 进行稀释，然后
                MMP）是Zn 依赖的蛋白水解酶，可分为6大类28个                        将二者混合后静置 15 min 再加细胞，置 37 ℃、5%
                          2+
                成员，多由成纤维细胞和肿瘤细胞等合成，通过降                            CO2条件下继续培养。
                解细胞外基质而促进肿瘤转移               ［4-5］ 。有资料显示，             细胞划痕实验：将转染siIL⁃17RA质粒的H1299
                MMP2广泛表达，在乳腺癌转移中起增强效应                  ［4-5］ 。本   细胞饥饿 12 h 再行培养。当融合度达 90%时，用
                课题前期体外实验已发现，受IL⁃17刺激的NSCLC细                       200 μL 移液器吸头产生细胞单层的线性伤口，PBS
                胞中MMP2的表达显著增加。                                    清洗后加含 1%FBS 的 DMEM，同时加 50 ng/mL 的
                    已知腺病毒 E1A 相关 300 kDa 蛋白（adenoviral            IL⁃17。继续培养并在 0 h和24 h观察其生长情况。
                E1A binding protein of 300 kDa，p300）是一种转录辅            Transwell实验：将转染siIL⁃17RA的H1299细胞
                        ［7］
                激活因子 。研究证实，p300能促进NSCLC的迁移与                       饥饿 12 h 再接种至含 1%FBS DMEM 的 Transwell 小
                侵袭，其机制与p300辅助修饰某些转录因子促进                           室中（5×10 个/孔）。另下室加 600 μL 相同的培养
                                                                            4
                了靶基因的表达有关 。本课题前期研究表明，用                            液。培养 24 h 去除上清，并洗去未穿透膜的细胞。
                                    ［7］
                IL⁃17刺激NSCLC细胞后，其胞内p300和MMP2的表                    迁移到膜下的细胞行100%甲醇固定和0.1%结晶紫
                达明显上调。因此，IL⁃17上调的p300是否能通过调                       染色。显微镜下观察后拍摄5个随机选择的视野。
                控MMP基因表达增强NSCLC细胞的侵袭和转移，值                         1.2.3  IL⁃17 刺激 H1299 细胞后检测不同时间 p300
                得进一步探究。                                           和MMP2的表达
                                                                      收集 IL⁃17 刺激后 0、1、2、3、6、12 h 的 H1299 细
                1  材料和方法
                                                                  胞蛋白，行 Western blot 检测 p300 和 MMP2 的表达，
                1.1  材料                                           方法同前。
                    人正常支气管上皮细胞系 BEAS⁃2B 和 NSCLC                   1.2.4  沉默IL⁃17RA基因后p300和MMP2蛋白表达
                细胞系（A549、PC9、H1299）由武汉大学中国典型培                     的测定
                养物保藏中心提供。                                             将siIL⁃17RA质粒转染H1299细胞后48 h，再用

                    胎牛血清（南京诺唯赞生物公司）；Lipofectamine                 IL⁃17 刺激 3 h。用 Western blot 检测 p300 和 MMP2
                2000（赛默飞世尔科技公司，美国）；兔 p300 多克隆                     的表达，实验分组及检查方法同前所述。
                抗体（CST 公司，美国）；兔 MMP2 多克隆抗体（杭州                     1.2.5  过表达或沉默 p300 对细胞迁移、侵袭及
                华安生物公司）；小鼠β⁃actin 单克隆抗体（上海碧                       MMP2表达的影响
                云天生物公司）；羊抗兔、鼠 IgG⁃HRP 二抗（合肥                       1.2.5.1  p300 过表达和 shp300 小干扰质粒的来源
                Biosharp 公司）。siIL⁃17RA 购买于上海吉玛基因公                 及验证
                司。                                                    将 p300 过表达质粒用 Lipofectamine 2000 转染
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