Page 26 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第2期
·172 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年2月

expression of Nrf2，improved the expression level of ROS and blocked cell cycle，thus accelerating apoptosis and inhibiting the growth
of tumor cells. SFN may be a safe and effective anti⁃cancer drug.
［Key words］ sulforaphane；active oxygen species；apoptosis；ERK phosphorylation
［J Nanjing Med Univ，2022，42（02）：171⁃177］

肿瘤的发生发展非常复杂，涉及到多个基因和 中心，生长培养基为含10%胎牛血清的RPM1640培
多个通路的紊乱，尽管近年来国内外在肿瘤的预防 养基（Gibco公司，美国），置于37 ℃、5％ CO2的培养
和治疗研究方面取得了较大的进展，但是恶性肿瘤 箱中培养，取对数生长期细胞做后续实验。
造成的患者死亡率仍然很高，对肿瘤的预防和治疗仍 1.2.2 CCK8增殖实验
然是医学科研界面对的一大难题。研究发现，人们日 细胞增殖实验CCK8检测SFN 对LLC 细胞增殖
常食用的植物或水果中含有丰富的抗肿瘤成分，如绿 能力的影响。用胰蛋白酶消化对数期生长的 LLC
茶中含有茶多酚 ［1-2］ ，葡萄中含有漆树黄酮 ［3-4］ ，十字花 细胞，制成单细胞悬液以每孔2×10 个/mL细胞接种
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科植物含有硫代葡萄糖苷 ［5-6］ 等。 到 96 孔板中，每孔设置 5 个复孔，继续培养 24 h 后
莱菔硫烷（sulforaphane，SFN）又名萝卜硫素，是 进行分组及不同浓度 SFN 处理，分别在处理 6、24、
一种主要存在于西兰花和其他十字花科蔬菜中的 48、72 h终止培养，每孔加入CCK8试剂10 μL后继续
异硫氰酸盐类物质，能够在肿瘤的起始与肿瘤发展 放入培养箱孵育3 h，最后在酶标仪上测各孔450 nm
的各个环节发挥作用，是抗肿瘤能力最强的植物活 波长处的吸光值，绘制细胞生长曲线。
性物质之一 ［7-8］ 。目前，有报道称SFN对肿瘤增殖的 1.2.3 细胞凋亡检测
抑制、对肿瘤细胞凋亡的诱导以及化学致癌物代谢 胰蛋白酶消化对数期生长的 LLC 细胞，制成单
的影响都显示出很好的预防前景 ［9-11］ 。但是对 SFN 细胞悬液以每孔 3×10 个/mL 细胞接种到 6 孔板中，
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的研究还需要更加深入，目前缺乏对SFN 作用机制 培养 24 h 后进行不同浓度 SFN 处理，细胞经 SFN 后
的全面了解。SFN 参与多种细胞生命活动，与 SFN 用不含 EDTA 的胰酶消化细胞，终止消化后收集细
相互作用的分子有待鉴定，对细胞周期调控、细胞 胞，用 PBS 洗涤离心 2 次后加入 100 μL 的 binding
凋亡、细胞信号转导等的影响机制还需要更进一步 buffer 和 5 μL 的荧光团标记的抗体（Annexin V⁃
探讨。本研究拟用不同浓度的 SFN 作用于小鼠肺 APC、7⁃ADD），室温孵育 15 min，加入 400 μL 的
癌细胞系（Lewis lung cancer cells，LLC）细胞，观察其 binding buffer后再流式细胞仪上检测凋亡情况。结
对 LLC 细胞生长、凋亡、氧化应激反应和信号通路 果用FlowJo 7.6.1分析细胞凋亡率。
的影响，探寻 SFN 抑制 LLC 细胞生长的作用及其作 1.2.4 细胞周期试验
用机制。 取对数生长期LLC细胞悬液，接种于6孔板，每
孔接种数为 5×10 个细胞，各细胞孔分别加入 0、
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1 材料和方法
12.5、25.0 μmol/L SFN。加药后48 h胰酶消化细胞，
1.1 材料 PBS 洗 2 遍后，用 70%冰乙醇重悬，于-20 ℃固定过
SFN、DCFH⁃DA探针（Sigma公司，美国），CCK⁃8 夜。固定离心后PBS清洗2遍，进行PI染色后流式细
溶液、RIPA 裂解液、BCA 试剂及 ECL 试剂盒（上海 胞仪检测，Modifit软件分析结果，实验过程重复3次。
碧云天公司），细胞凋亡检测试剂盒（BioLegend 公 1.2.5 基因表达量检测

司，美国），细胞周期检测试剂盒（BD公司，），TRIzol 根据 NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）上GAP⁃
试剂（Invitrogen 公司，美国），反转录试剂盒、DNA DH、CyclinD1、CDK4、CDK6、CDK1 和 CyclinB1 基因
Marker DL2000、SYBR Premix Ex TaqTM（Perfect Re⁃ 核苷酸序列，利用 DNAMAN 6.0 及 Primer Premier
al Time）（大连 TaKaRa 公司），兔抗鼠 ERK、p⁃ERK、 5.0软件，设计正、反向引物（表1），引物合成和测序
Nrf2、β⁃actin mAb（Abcam公司，美国）。 由上海生工生物公司完成。

1.2 方法 提取 12.5、25.0 μmol/L SFN 处理 24 h、48 h 的
1.2.1 细胞及培养 LLC 细胞 RNA，RNase free H2O 充分溶解，测定其浓
LLC细胞购自中国科学院上海生科院细胞资源 度，于-80 ℃保存备用。取5 μL（100 ng/μL）RNA进