Page 34 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第2期
               ·180 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年2月


              1.2.4 Western blot法检测蛋白表达                         照组相比,低剂量组、高剂量组的表皮发生不规则
                  兰索拉唑孵育细胞后,加裂解液于冰上静置                           增厚,角质细胞坏死,并出现细胞水肿,炎症细胞外
              10 min 后刮下细胞。细胞破碎超声后,于 4 ℃、                       渗及叠痂等现象。高剂量组与低剂量组相比炎症
              14 000 r/min 离心 15 min 后取上清。BCA 试剂盒测              表现更加显著,增生更严重。IL⁃6 免疫组化结果显
              定蛋白样品的浓度,调齐浓度加入5×蛋白上样缓冲                           示长期予兰索拉唑灌胃后,空白对照组IL⁃6几乎不
              液,蛋白样品煮沸变性后-20 ℃保存。配胶后每个                          表达,低剂量组呈低表达,而高剂量组则高表达 IL⁃
              泳道均以 35 μg 总上样量进行电泳,待蛋白分离后                        6,提示小鼠出现炎症损伤。
              停止电泳。湿转法将蛋白转至PVDF 膜上,5%脱脂                         2.2  兰索拉唑可降低HaCaT细胞活力
              奶粉溶液室温下封闭90 min。经1× TBST缓冲液漂                           选用 10~200 μmol/L 兰索拉唑处理细胞 24 h 或
              洗后,4 ℃ 冰箱一抗孵育过夜。隔日用TBST漂洗条                        48 h后,统计吸光值并分析。结果如图2所示,随着
              带10 min,重复3次。摇床上二抗室温孵育1.5 h,结                     兰索拉唑给药浓度的增加,细胞存活率逐渐下降。
              束后仍用 TBST 缓冲液漂洗,最后进行曝光。以                          孵育过程中,显微镜下观察细胞状态,较高浓度培
              GAPDH 为内参,用 Image J 软件对 Western blot 条带           养后细胞生长减缓、形态皱缩、细胞活力降低。根
              的灰度值进行半定量分析,各给药组目的蛋白的表                            据细胞存活率作折线图,由 Hill 方程计算得兰索拉
              达通过对照组进行标准化。                                      唑孵育 24 h 后对应的半抑制浓度(IC50 )为 134.5

              1.3  统计学方法                                        μmol/L,而 48 h 对应的 IC50为 89.98 μmol/L,此时细
                  实验数据用均数±标准差(x ± s)表示,采用                       胞生长抑制率为 50%,这说明兰索拉唑可降低 Ha⁃
              Graphpad Prism 8.0 软件进行画图、非线性拟合,多                 CaT 细胞的生长活力,且与 24 h 相比,48 h 的 IC50更
              组间的比较使用单因素方差分析和Turkey’s检验或                        低,因此孵育时间越长,兰索拉唑对细胞活力的降
              Dunnett T3检验,P < 0.05为差异有统计学意义。每                  低程度越大。
              项实验均独立重复3次。                                       2.3  兰索拉唑可活化 NF⁃kB 通路促进 HaCaT 炎症
                                                                因子表达
              2  结 果
                                                                     选用 10~40 μmol/L 的兰索拉唑处理细胞 24 h、
              2.1  长期灌胃兰索拉唑后,小鼠皮肤组织出现炎症                         48 h后,同时予DMSO作对照,检测分析各组细胞中
              损伤                                                炎症因子的表达量。兰索拉唑孵育 HaCaT 24 h 结
                  皮肤组织切片的HE染色结果如图1所示,与对                         果如图3所示,与对照组相比,蛋白p65的磷酸化水


                                        HE                                         IL⁃6免疫组化
                             ×10                   ×40                     ×10                    ×40

                  对照组







                )  250
                ( kg·d )

                ( mg/
                兰索拉唑  000


                  1

                                                      箭头处存在坏死性病变。
                                          图1   小鼠皮肤组织切片的HE染色和IL⁃6免疫组化
                              Figure 1 HE staining and IL⁃6 immunohistochemistry of mouse skin tissue sections
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