Page 34 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第2期
·180 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年2月
1.2.4 Western blot法检测蛋白表达 照组相比，低剂量组、高剂量组的表皮发生不规则
兰索拉唑孵育细胞后，加裂解液于冰上静置 增厚，角质细胞坏死，并出现细胞水肿，炎症细胞外
10 min 后刮下细胞。细胞破碎超声后，于 4 ℃、 渗及叠痂等现象。高剂量组与低剂量组相比炎症
14 000 r/min 离心 15 min 后取上清。BCA 试剂盒测 表现更加显著，增生更严重。IL⁃6 免疫组化结果显
定蛋白样品的浓度，调齐浓度加入5×蛋白上样缓冲 示长期予兰索拉唑灌胃后，空白对照组IL⁃6几乎不
液，蛋白样品煮沸变性后-20 ℃保存。配胶后每个 表达，低剂量组呈低表达，而高剂量组则高表达 IL⁃
泳道均以 35 μg 总上样量进行电泳，待蛋白分离后 6，提示小鼠出现炎症损伤。
停止电泳。湿转法将蛋白转至PVDF 膜上，5%脱脂 2.2 兰索拉唑可降低HaCaT细胞活力
奶粉溶液室温下封闭90 min。经1× TBST缓冲液漂 选用 10~200 μmol/L 兰索拉唑处理细胞 24 h 或
洗后，4 ℃ 冰箱一抗孵育过夜。隔日用TBST漂洗条 48 h后，统计吸光值并分析。结果如图2所示，随着
带10 min，重复3次。摇床上二抗室温孵育1.5 h，结 兰索拉唑给药浓度的增加，细胞存活率逐渐下降。
束后仍用 TBST 缓冲液漂洗，最后进行曝光。以 孵育过程中，显微镜下观察细胞状态，较高浓度培
GAPDH 为内参，用 Image J 软件对 Western blot 条带 养后细胞生长减缓、形态皱缩、细胞活力降低。根
的灰度值进行半定量分析，各给药组目的蛋白的表 据细胞存活率作折线图，由 Hill 方程计算得兰索拉
达通过对照组进行标准化。 唑孵育 24 h 后对应的半抑制浓度（IC50 ）为 134.5
1.3 统计学方法 μmol/L，而 48 h 对应的 IC50为 89.98 μmol/L，此时细
实验数据用均数±标准差（x ± s）表示，采用 胞生长抑制率为 50%，这说明兰索拉唑可降低 Ha⁃
Graphpad Prism 8.0 软件进行画图、非线性拟合，多 CaT 细胞的生长活力，且与 24 h 相比，48 h 的 IC50更
组间的比较使用单因素方差分析和Turkey’s检验或 低，因此孵育时间越长，兰索拉唑对细胞活力的降
Dunnett T3检验，P < 0.05为差异有统计学意义。每 低程度越大。
项实验均独立重复3次。 2.3 兰索拉唑可活化 NF⁃kB 通路促进 HaCaT 炎症
因子表达
2 结 果
选用 10~40 μmol/L 的兰索拉唑处理细胞 24 h、
2.1 长期灌胃兰索拉唑后，小鼠皮肤组织出现炎症 48 h后，同时予DMSO作对照，检测分析各组细胞中
损伤 炎症因子的表达量。兰索拉唑孵育 HaCaT 24 h 结
皮肤组织切片的HE染色结果如图1所示，与对 果如图3所示，与对照组相比，蛋白p65的磷酸化水
HE IL⁃6免疫组化
×10 ×40 ×10 ×40
对照组
） 250
（ kg·d ）
（ mg/
兰索拉唑 000
1
箭头处存在坏死性病变。
图1 小鼠皮肤组织切片的HE染色和IL⁃6免疫组化
Figure 1 HE staining and IL⁃6 immunohistochemistry of mouse skin tissue sections
