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第42卷第2期              韩  晟，周锦仁，邵 青，等. MCT1在预测肝细胞癌患者预后中的作用研究［J］.
                  2022年2月                   南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（02）：184-188，210                     ·185 ·


                调节性 T 细胞（Treg）是一类具有免疫调节功能的 T                      GAGTTGACC⁃3′，Reverse Primer：5′⁃TCAGTCCTTG⁃
                细胞亚群，在肿瘤中可观察到明显升高的 Treg 浸                         GATAGTGAGGTTC ⁃ 3′ ；IL ⁃ 10，Forward Primer：5′ ⁃
                润，这类细胞可通过多种途径抑制效应性细胞激                             ATAAAAGGGGGACACCGGGC⁃ 3′，Reverse Primer：
                活，诱导肿瘤免疫逃逸          ［2-4］ 。近年来文献表明，肿瘤             5′⁃CTCATAACCCATGGCTTGGC⁃3′。
                代谢产物乳酸在调控肿瘤内 Treg 功能方面具有核                         1.2.2 流式细胞仪检测
                心作用    ［5］ ，而单羧酸转运蛋白 1（monocarboxylate                运用Ficoll 淋巴细胞分离液从肝素抗凝静脉血
                transporter，MCT1）是肿瘤环境中最重要的乳酸转运                   中提取 PBMC，加入抗 CD4、CD8、CD25、CD127 等流
                载体 。本研究以南京医科大学第一附属医院行肝                            式抗体，运用流式细胞仪检测外周血细胞分型差
                    ［6］
                切除术的 HCC 患者作为研究对象，探讨 MCT1 表达                      异。PBMC 在进行表面染色后，PBS 洗涤 2 次，加入
                水平在HCC预后评估中的作用和可能机制。                              固定剂固定，破膜剂打孔后，离心弃上清液后进行
                                                                  胞内Foxp3染色。4 ℃孵育30 mins后PBS洗涤并上
                1  材料和方法
                                                                  机检测。流式图像和数据采用Flowjo software处理。
                1.1  材料                                           1.2.3 乳酸处理和Treg诱导效率检测
                    为探讨 MCT1 在 HCC 预后评估中的作用，团队                        运用磁珠分选仪（美天旎公司，德国）分选CD4                    +
                收集了 2018 年于南京医科大学第一附属医院行肝                         CD45RA T 细胞，流式细胞仪检测所得细胞纯度
                                                                          +
                部分切除术的 43 例 HCC 患者的肝癌组织与癌旁组                      （>97%），随后在CD4 CD45RA T细胞中加入抗CD3/
                                                                                             +
                                                                                     +
                织标本。为分析 HCC 患者免疫细胞对乳酸的反应                          CD28 扩增磁珠（1 磁珠∶3 细胞），TGF⁃β（20 ng/mL）
                活性以及 MCT1 表达水平对 Tregs 分化和功能的影                     和IL⁃2（100 U/mL）培养7 d，运用流式检测技术分析
                响，收集了2021年于南京医科大学第一附属医院行                          Treg诱导的情况。
                肝部分切除术的 10 例患者的肝癌组织与癌旁组织                          1.3  统计学方法
                标本以及外周血标本，所有患者均有完整病历临床                                应用SPSS21.0统计软件，对于计数资料的组间
                资料并签署知情同意书，所有程序均符合南京医科                            比较使用χ 检验，数值变量资料的组间比较使用t检
                                                                            2
                大 学 伦 理 委 员 会 研 究 伦 理 委 员 会 的 伦 理 标 准             验。生存分析采用Kaplan⁃Meier法进行分析并进行
               （SYXK2018⁃0020）。                                   Log⁃rank检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
                    纳入标准：①经临床综合检查，符合 HCC 诊断
                                                                  2  结 果
                标准；②手术前有明显的炎症感染；③截至目前有
                完整的随访资料。排除标准：①免疫系统疾病或感                            2.1  HCC患者外周T细胞MCT1高表达导致Treg分
                染性疾病；②合并其他肿瘤；③手术治疗前曾接受                            化倾向
                其他抗肿瘤治疗（介入、药物、放疗等）。                                   为研究 MCT1 基因的表达差异与患者 T 细胞分
                1.2  方法                                           化以及Treg功能的关系，收集了因HCC行肝切除患
                1.2.1 RT⁃PCR                                      者的肿瘤与癌旁标本以及外周血，并统计和整理了
                    根据说明书，利用RNA提取试剂盒提取组织中                         相应的临床信息。通过qPCR检测比较肿瘤与癌旁
                的总 RNA，逆转录得到 cDNA。根据试剂盒说明书                        表达MCT1的mRNA比率，随后通过MCT1表达的高
                配置 25 μL 反应体系，包括逆转录产物2 μL，上、下                     低将患者人为进行排序，分为 MCT1 高表达组和
                游引物各 1 μL，Taq 酶 0. 2 μL，2 × Buffer 12. 5 μL，      MCT1低表达组（图1A）。运用流式细胞技术检测各

                                                                                                              +
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                ddH2O 8. 3 μL。反应条件：95 ℃预变性 5 min；95 ℃             患者的外周血分型，结果显示无论是 CD4 T、CD8 T
                                                                                 +
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                                                                                             -
                变性 20 s，62 ℃退火并延伸 1 min，循环 40 次；72 ℃              细胞抑或是 CD4 CD25 CD127 Treg 细胞，均无明显
                总延伸 5 min。                                        差异（图1B、C）。实际上，肿瘤微环境与外周血存在
                    相关引物序列设计如下：MCT1，Forward Prim⁃                 明显差异，而近年研究显示，糖酵解的发生和乳酸沉
                er：5′⁃CAATGCCACCAGCAGTTG⁃3′，Reverse Prim⁃         积是肿瘤微环境的重要组成部分               ［7-9］ 。因此，通过对
                er：5′⁃GCAAGCCCAAGACCTCCAAT⁃3′；Foxp3，For⁃          naïve T 细胞进行乳酸处理来模拟肿瘤微环境。运
                                                                                              +
                                                                                                       +
                ward Primer：5′⁃GTGGCCCGGATGTGAGAAG⁃3′，Re⁃         用 10 nmol/L 乳酸处理各组 CD4 CD45RA naïve T 细
                verse Primer：5′ ⁃ GGAGCCCTTGTCGGATGATG ⁃ 3′ ；     胞后，观察到添加乳酸明显升高 MCT1 高表达组的
                CTLA4，Forward Primer：5′ ⁃ CATGATGGGGAAT⁃          Foxp3表达，提示MCT1基因高表达患者的T细胞更
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