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第42卷第3期          徐抒语，李书书，王 丽，等. CYP2B6对农药p，p’⁃DDT的代谢活性及代谢产物解析［J］.
                  2022年3月                     南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（03）：407-414                       ·409 ·


                1.2.2 体外代谢动力学分析                                   丙醇，沉淀蛋白。再加入 3 mL 正己烷/甲基叔丁基
                    由磷酸盐溶液（pH=7.4，50 mmol/L）、NADPH 产              醚（体积比 1∶1），重复3次，充分振荡吸上层有机相于
                                       +
                生系统（0.24 mmol/L NADP 、3.3 mmol/L G6P、2 mmol/L     干净试管中，合并3次有机相后用氮气吹干。最后用
                EDTA、3.3 mmol/L MgCl2 ）、合适浓度重组酶CYP2B6             3 mL 正己烷/甲基叔丁基醚（体积比 1∶1）复溶后备
               （82 nmol）/8⁃MOP 抑制剂和预先溶于乙腈溶液的                      用。过弗罗里硅土柱，收集洗脱液。用6 mL正己烷/
                p，p’⁃DDT（0~600 μmol/L）组成孵育体系（共250 μL），            甲基叔丁基醚（体积比 1∶1）洗脱，合并洗脱液，氮气
                1.5 mL EP 管中振荡混匀，置于 37 ℃培养箱中孵育                    吹至近干。加入 500 μL 甲苯、100 μL 吡啶、100 μL
                30 min，加入等体积预冷乙腈终止反应，4 ℃ 16 000 g                 乙酸酐，充分混匀，60 ℃水浴 30 min。加入 700 μL
                离心5 min，取上清液上机检测，所有实验平行重复3次。                      去离子水终止反应。用 3 mL 正己烷萃取，重复

                    p，p’⁃DDT以及代谢产物p，p’⁃DDD、p，p’⁃DDE               3 次，合并有机相，氮气吹干，加入 100 μL CH2Cl2溶
                的定量参照标准品标准曲线。根据米氏动力学方                             解。将上述样品转移至250 μL内衬管待测。
                                                                  1.2.5 大鼠肝脏微粒体制备
                程对实验数据进行计算，得到动力学参数（Km、Vmax
                                                                      称取 300 mg 大鼠肝脏组织于离心管中，加入
                和CLint ），公式为：V=Vmax ×［S］/（Km+［S］），CLint=Vmax/Km
               （其中 V 为反应速度，［S］为底物浓度，Km为 M⁃M 常                     1 mL 裂解液，冰上剪碎后超声，转移至新离心管中。
                数，Vmax为最大反应速率）。                                   4 ℃、12 000 g离心20 min，转移上清液至新的离心管
                1.2.3 动物染毒模型构建                                    中。之后4 ℃、100 000 g离心1 h，弃上清，加入适量微

                    20只清洁级10周龄SD雄性大鼠（Sprague⁃Daw⁃                 粒体蛋白超声悬浮缓冲液重悬。测定浓度备用。
                ley）购自上海斯莱克实验动物有限责任公司［实验                          1.2.6 大鼠肝脏CYP2B1酶活性测定
                动物生产许可证号：SCXK（沪）2007⁃2005，合格证                         大鼠肝脏微粒体置于冰上，避免光照。取适量
                号：0018341］，体重范围 250~300 g。饲养于 SPF 屏               GENMED缓冲液（Reagent A）、GENMED反应液（Re⁃
                障中心，自由摄取水与饲料，环境温度控制为（25±                          agent B）和 GENMED 底物（Reagent C）至离心管中，
                0.5）℃，相对湿度为 55%，明暗交替周期 12 h/12 h。                 并分别加入新配的标准液到相应孔中。37 ℃孵育
                动物饲养、环境维护以及实验安排均按照南京医                             20 min，避免光照；加入适量 GENMED 终止液（Re⁃
                科大学实验动物福利伦理委员会指导原则进行。                             agent D）混匀；放入荧光分光光度仪中检测，并读取
                大鼠适应环境 1 周后，随机分为对照组和实验                            相应荧光读数（relative fluorescence unit，RFU）；后以
                组。对照组尾静脉注射0.5 mg/kg乙醇溶剂，实验组                       RFU 为 Y 轴，标准羟基异吩噁唑酮浓度为 X 轴构建
                尾静脉注射 100 mg/（mL·kg）抑制剂 KR⁃Ⅱ；每组再                  标准曲线。96 孔板中加入适量 GENMED 缓冲液
                分别随机分为2个亚组，1 h后一组尾静脉注射玉米                         （Reagent A）、GENMED 反 应 液（Reagent B）和
                油，另一组注射 40 mg/（mL·kg）p，p’⁃DDT。分别在                 GENMED 底物（Reagent C），再分别加入 25 μL 标准
                给药前，给药后10、20、30 min眼眶静脉取血。实验                      液或待测样品（20 μg 肝脏微粒体蛋白），37 ℃孵育
                结束后，收集肝组织样本并保存于-80 ℃冰箱备用。                         20 min；将其放入荧光分光光度仪中检测，并读取相
                1.2.4 大鼠血清和肝脏样本的处理                                应 RFU，根据标准曲线获得对应羟基异吩噁唑酮浓
                    大鼠血清加入盐酸（6 mol/L），涡旋2 min 静置，                 度；并转化为酶活性=［对应羟基异吩噁唑酮浓度
                加入 0.5 mL 异丙醇，涡旋2 min静置，再加入3 mL正                 （nmol/L）× 0.2 mL（体系容量）×样品稀释倍数］/20 min
                己烷/甲基叔丁基醚（体积比1∶1），涡旋2 min，静置至                    （反应时间）。
                分层，吸取上清液至另一干净 EP 管中，重复操作                          1.3  统计学方法
                2 次。用氮气将上清液吹至近干，以1 mL正己烷/二                            数据用均数±标准差（x ± s）表示，采用 SPSS
                氯甲烷（体积比1∶1）溶解。将溶解液加入到已经用                          23.0 软件进行统计分析，多个样本均数比较采用单
                正己烷活化（正己烷/二氯甲烷体积比 1∶1）的弗罗                         因素方差分析，进一步两两比较采用 LSD⁃t 检验，
                里硅土小柱中，以正己烷/二氯甲烷洗脱 3 次，每次                         P < 0.05为差异有统计学意义。
                2 mL，收集3次洗脱液用氮气吹干，使用0.1 mL正己
                                                                  2 结 果
                烷定容后待测。
                    称取300 mg大鼠肝脏组织，加入2 mL去离子水，                    2.1 DDT检测方法的建立
                匀浆。加入500 μL盐酸使蛋白变性，加入500 μL异                          建立分析 DDT（p，p’⁃DDT、o，p’⁃DDT、p，p’⁃
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