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第42卷第3期 仲逢钰，秦振英，李 婧，等. MiR⁃484通过靶向MAPK8抑制人前体脂肪细胞的增殖与分化［J］.
2022年3月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（03）：325-332 ·327 ·

getscan.org/vert_72/）对 miR⁃484 的靶基因及潜在的 在 100 ℃金属浴煮沸 10 min 变性。采用 10%SDS/
结合位点进行了预测。使用DAVID 6.7在线数据库 PAGE 凝胶和聚偏氟乙烯膜分离及转移蛋白，将膜
（https：//david.ncifcrf.gov/）进行基因本体（Gene On⁃ 在室温下用5%牛奶封闭1 h后，与适当稀释的特异
tology，GO）分析、KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes 性抗体（MAPK8、β⁃actin）一起 4 ℃孵育过夜，TBST
and Genomes）富集分析。为了验证结合位点，构建 洗涤膜 3 次，然后加入二抗，在摇床中孵育 1 h。最
了荧光素酶报告质粒 MAPK8 的野生型和突变型。 后用超敏ECL化学发光试剂检测曝光蛋白条带。
将 293T 细胞接种到 24 孔板中，以含 10%胎牛血清 1.3 统计学方法
的DMEM 培养基培养。当细胞密度达到70%时，将 采用 SPSS 23.0 软件进行统计分析。定量资料

野生型或突变型质粒与 miR⁃484 mimic 及 miR⁃484 以均数±标准差（x ± s）表示，3组独立样本之间的差
mimic NC 共转染到 293T 细胞中。24 h 后使用双荧 异采用重复测量方差分析检验，当 3 组独立样本间
光素酶报告分析试剂盒测量荧光素酶活性。 的差异有统计学意义时，SNK 法进行组间两两比
1.2.6 RT⁃qPCR检测 较。采用Graphpad Prism 绘制直条图、复式直条图、

使用TRIzol法提取细胞的总RNA，使用TaKaRa 线图等。P＜0.05为差异有统计学意义。
反转录试剂盒进行 mRNA 和 miRNA 的逆转录，用
2 结 果
SYBR Premix Ex Taq试剂盒（TaKaRa）进行定量实时

聚合酶链反应。使用2 -ΔΔCT 法计算mRNA和miRNA的 2.1 miR⁃484 在 HPA 分化过程中的表达及其过表
相对表达水平。β⁃actin用作mRNA的内部标准化对 达验证
照，U6用作miRNA的内部标准化对照。qRT⁃PCR检 为了验证 HPA 分化过程中 miR⁃484 的表达情
测中使用的引物序列见表1。 况，分别取分化第0天、第4天、第8天、第15天的细
1.2.7 Western blot实验 胞，使用 RT⁃qPCR 技术检测，结果与未分化的细胞
用RIPA法提取细胞蛋白，BCA法测定蛋白浓度 （第 0 天）相比，随着分化的进行，miR⁃484 表达量逐
后加入上样缓冲液，将蛋白样品的浓度定为20 ng/mL， 渐降低（P < 0.05），表明miR⁃484可能参与HPA的分

表1 实时定量PCR目的基因的引物
Table 1 The sequences of the primers for RT⁃qPCR

目的基因 正向引物（5′→ 3′） 反向引物（5′→ 3′）
β⁃actin CACTATCGGCAATGAGCGGTTCC CAGCACTGTGTTGGCATA GAGGT
U6 GTGCTCGCTTCGGCAGCACATATAC AAAAATATGGAACGCTTCACGAATTTG
miR⁃484 ACACTCCAGCTGGGTCAGGCTCAGTCCCCT TGGTGTCGTGGAGTCG
MAPK8 CCCAAGCTTATGAGCAGAAGCAAGCGT CCGGAATTCTCATCTACAGCAACCCAGAGGAATTC
Cyclin D1 ACCTCTGGCTCTCTGTGCCTTCTAT GTCCCACCTTCACCTCTTCCCT
Cyclin D3 AGATCAAGCCGCACAT ATCCAGGTAGTTCATAGCC
CDK4 CTACATACGCAACACCCG TCAAAGATTTTCCCCAACT
PPAR γ AAGAGCTGACCCAATGGTTG ACCCTTGCATCCTTCACAAG
C/EBP α CGCAAGAGCCGAGATAAAGC CGGTCATTGTCACTGGTCAACT
FABP4 TAAAAACACCGAGATTTCCTTCA CCTTTCATAACACATTCCACCA

化（图1A）。此外，为了验证miR⁃484过表达体系的 48 h HPA的增殖能力，发现与对照组及mimic NC组
建立，在HPA中转染了miR⁃484及其空白质粒，通过 相比，miR⁃484 mimic组在24 h及48 h的吸光度值降低
RT⁃qPCR发现miR⁃484表达较对照组及mimic NC组 （P < 0.05，图2A）。同时对细胞周期相关基因Cyclin
增高（P < 0.05，图1B）。 D1、Cyclin D3 和 CDK4 的 mRNA 相对表达量进行了

2.2 过表达miR⁃484抑制HPA增殖分化 检测，RT⁃qPCR 实验发现 miR⁃484 mimic 组的细胞
为了进一步了解过表达miR⁃484对脂肪生成的 周期相关基因表达量均减少（P < 0.05，图2B），由此
作用，将miR⁃484 mimic及miR⁃484 mimic NC分别转 可见，过表达miR⁃484可以抑制HPA的增殖。
染至 HPA 中。CCK⁃8 实验检测转染后 0 h、24 h 及 为了研究 miR⁃484 对 HPA 成脂分化的影响，在