Page 24 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第3期
               ·326 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年3月


              代谢对降低肥胖发生率具有重要意义。                                 Kit⁃8，上海碧云天生物技术研究所）；Lipofectamine
                  脂肪生成是一个复杂的过程，与多种转录因子                          3000（Invitrogen 公司，美国）。Real⁃time PCR 仪（型
              的动态表达有关。前体脂肪细胞的增殖和分化增                             号：ViiA7）（UVP公司，美国），紫外分光光度计（上海
              加成熟脂肪细胞的数量，促进了甘油三酯的储存、代                           美谱达仪器有限公司）。
                                ［8］
              谢，并产生脂肪因子 。微小核糖核酸（microRNA，                       1.2  方法
              miRNA）是一类内源性非编码单链RNA（18~24核苷                      1.2.1 细胞培养与质粒转染
              酸），通过与靶mRNA的3′非翻译区（3′UTR）特异性                           培养板中按1×10 个/mL接种HPA（Science Cell
                                                                                    5
              结合，在转录后水平负调控基因表达 。一些研究                            公司，美国），在37 ℃、5%CO2孵箱中，以含5%胎牛血
                                               ［9］
              表明，miRNA 可能和脂肪细胞的分化增殖发生相                          清的人脂肪细胞培养基培养，每2 d换液1次，待细胞
              关。例如，Chen等      ［10］ 发现miR⁃146b是人内脏前脂肪            贴壁生长至完全融合并接触抑制2 d后（第0天）开始
              细胞增殖和分化的调节因子，其表达在人体内发生                            诱导分化。具体步骤为：培养基换用 DMEM 高糖
              改变。miR⁃130b 可以靶向过氧化物酶体增殖物活                        培养基，其中含0.5 mmol/L MIX、1 μmol/L地塞米松、
              化受体γ（peroxisome proliferator activated receptor γ，  5 μg/mL胰岛素和1 μmol/L罗格列酮，培养4 d。随后
              PPARγ）抑制猪脂肪沉积          ［11］ 。既往研究发现 miR⁃          分化培养基中撤去 MIX、地塞米松、罗格列酮，使
              484 在肥胖妇女或儿童的脂肪组织中差异表达                    ［9，12］ ，  DMEM高糖培养基中只含有5 μg/mL胰岛素。后每
                                            ［13］
              同时其表达与组织缺血再灌注损伤 、宫颈癌肿瘤发                           3 d 换液 1 次，直至第 15 天，约 85%以上的细胞已分
              生 、肝硬化 等有关。然而，miR⁃484在肥胖中的作                       化为成熟人脂肪细胞。为了评价miR⁃484对HPA增
                ［14］
                         ［15］
              用仍不清楚。本研究通过在人前体脂肪细胞（human                         殖和分化的影响，采用Lipofectamine 3000对细胞转
              preadipocytes，HPA）中过表达及沉默 miR⁃484，研究              染 miR⁃484 mimic、miR⁃484 inhibitor、MAPK8 过表
              其对HPA细胞增殖及成脂分化的影响，在细胞层面                           达质粒及其阴性对照。
              揭示miR⁃484对肥胖的作用，并探讨了其下游作用的                        1.2.2 CCK⁃8实验
              可能靶基因，以期为肥胖的防治提供一个新靶点。                                 为了研究HPA的增殖能力，使用CCK⁃8检测试
                                                                剂盒在 0 h、24 h、48 h 这 3 个不同的时间点进行检
              1  材料和方法
                                                                测。使用 10 μL CCK⁃8 溶液处理接种在 96 孔板中
                                                                      3
              1.1  材料                                           （5×10 个/mL）的脂肪细胞，孵育细胞 2 h 后，使用分
                  PBS、DMEM 高糖培养基、DMEM 培养基、胎牛                    光光度仪测定其450 nm处吸光度值。
              血清、青霉素/链霉素（P/S）、0.25%胰蛋白酶（Gibco                   1.2.3 油红O染色
              公司，美国）；含 5%胎牛血清的人脂肪细胞培养基                               油红 O 染色在室温下进行，取诱导分化成熟的
             （PAM，Science Cell 公司，美国）；3⁃异丁基⁃1⁃甲基黄               人脂肪细胞（第 15 天），用 PBS 洗涤细胞 3 次，后在
              嘌呤（MIX）、地塞米松、胰岛素、罗格列酮、油红O染                        10%多聚甲醛中固定1 h，吸取出固定液后晾干。油
              液（Sigma公司，美国）；miR⁃484、MAPK8、Cyclin D1、            红 O 溶解于异丙醇中，配成3 mg/mL的染液并过滤，
              Cyclin D3、CDK4、PPAR γ、CCAAT 增强子结合蛋白               随后加入晾干的细胞中染色1 h。最后，用PBS轻轻
             （CCAAT enhancer binding protein，C/EBP）⁃α、脂肪        洗涤细胞，倒置显微镜观察，镜下脂滴应成亮红色。
              酸结合蛋白 4（fatty acid binding protein 4，FABP4）、      1.2.4 细胞甘油三酯含量测定
              β⁃actin 及 U6 引物（广州锐博生物技术有限公司）；                         细胞接种于 6 孔板中，取分化成熟的人脂肪细

              miR⁃484 mimic、miR⁃484 mimic NC、miR⁃484 inhibi⁃    胞（第 15 天），PBS 轻柔洗涤细胞 1 次后用胰酶消化
              tor、miR⁃484 inhibitor NC、MAPK8 过表达质粒及其            细胞，收集细胞于离心管中，根据甘油三酯测定试

              阴性对照（吉满生物科技上海有限公司）；TRIzol（In⁃                     剂盒说明书，加入100 μL裂解液，室温裂解10 min，
              vitrogen 公司，美国）；逆转录试剂盒、实时荧光定量                     留取 20 μL 裂解液进行 BCA 法蛋白定量，70 μL 裂
              PCR 试剂盒、SYBR Green Master Mix（TaKaRa 公司，          解液70 ℃加热10 min后离心取上清，使用分光光度
              日本）；甘油三酯测定试剂盒（北京普利莱基因技术                           仪在510 nm处测量细胞裂解物中甘油三酯的含量，
              有限公司）；二甲基亚砜（DMSO）（Sigma 公司，美                      测定结果用总蛋白浓度校准。
              国）；兔抗人抗体 MAPK8、β⁃actin（Abcam 公司，英                 1.2.5 靶基因测定与验证
              国）；羊抗兔 IgG、CCK⁃8 检测试剂盒（Cell Counting⁃                  利用在线数据库 Targetscan7.2（http：//www.tar⁃
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