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第42卷第5期        周  璐，段    然，祝雯雯，等. 江苏省2016—2019年不同来源小肠结肠炎耶尔森菌血清、生物型
                  2022年5月         分布及分子特征分析［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（05）：724-728，745                 ·725 ·


                    小肠结肠炎耶尔森菌是一种全球分布的重要                           糖琼脂（北京陆桥技术有限责任公司）；Rustigian’s
                人兽共患病病原菌         ［1-2］ ，人类主要通过接触带菌动               尿素培养基（Oxoid 公司，英国）；革兰氏阴性细菌鉴
                物、被污染的土壤、水源等而感染，并引起腹泻、肠                           定卡（VITEC⁃2 GN Test kit，上海梅里埃诊断产品有
                炎以及类阑尾炎等多种肠道症状，严重者可引起肠                            限公司）；小肠结肠炎耶尔森菌分型血清（包括O：1，
                道外并发症，如关节炎、结节性红斑、心内膜炎等，                           2、O：3、O：5、O：8、O：9，生研式会社，日本）；细菌核
                                           ［3］
                甚至可引起败血症，造成死亡 。小肠结肠炎耶尔                            酸 提 取 试 剂 Wizard Genomic DNA Purification Kit
                森菌宿主广泛，除人以外，还有猴子、狗、猪、羊、啮                         （Promega公司，美国）；全自动生化鉴定仪（VETIC⁃2
                齿动物及鸟类等，有研究显示对人威胁最大的动物                            System，生物梅里埃公司，法国）。
                    ［4］
                为猪 。该病原菌也是一种重要的食源性致病菌，                            1.2  方法
                通过粪口途径传播，很多国家已将该菌列为进出口                            1.2.1 菌株分离鉴定
                食品的常规检测项目。小肠结肠炎耶尔森菌具有                                 按照团体标准《耶尔森菌病诊断》（T/CPMA 005⁃
                嗜冷性，在低温环境中也可生长繁殖，其产生的耐                            2019），将标本接种改良磷酸盐缓冲液，于 4 ℃分别
                热肠毒素不仅耐高温，也可在低温条件下保持数月                            增菌培养7 d、14 d、21 d后转种于麦康凯平板，26 ℃
                                          ［5］
                活性，所以也被称为“冰箱病” 。                                  培养 48 h，挑取可疑菌落分别接种改良克氏双糖琼
                    血清型和生物型是根据表型对小肠结肠炎耶                           脂斜面26 ℃培养48 h，产酸不产气且不产硫化氢者
                尔森菌进行分型的两种常规方法，不同国家或地区                            转种 Rustigian’s 尿素培养基，尿素阳性者分别转种
                致病性菌株血清型和生物型存在较大差异。根据                             两支半固体培养基，分别置于 26 ℃和 37 ℃培养
                菌体 O 抗原不同小肠结肠炎耶尔森菌可分为 60 多                        24 h。26 ℃有动力且 37 ℃无动力者为小肠结肠炎
                种血清型，日本以 O：3 为主，美国以 O：8 为主，我国                     耶尔森菌疑似菌株，进行革兰氏染色镜检和生化鉴
                致病性菌株以O：3和O：9血清型为主               ［6-7］ 。          定。鉴定为小肠结肠炎耶尔森菌的菌株用分型血
                    多位点序列分析（multilocus sequence typing，           清进行玻片凝集，并设盐水对照。
                MLST）是一种基于核酸序列测定的细菌分型方法，                          1.2.2 核酸提取
                通过扩增小肠结肠炎耶尔森菌的 7 个管家基因                                将培养好的菌苔刮至含 200 μL 生理盐水的
               （adk、argA、aroA、glnA、thrA、tmk、trpE）内部片段并测           1.5 mL EP管中。试剂盒提取细菌总DNA，操作步骤
                定其序列，分析菌株的变异情况，较其他方法操作                            参照试剂盒使用说明书，核酸-80 ℃保存待用。
                更加简单，便于不同实验室之间的比对，该技术常                            1.2.3 二代测序
                用于细菌的流行病学监测和进化研究。                                     细菌DNA采用Qubit Fluorometer 仪测定核酸浓
                    北欧是人感染小肠结肠炎耶尔森菌病的高发地                          度，琼脂糖凝胶电泳检查核酸完整性，合格样品送
                区，美国、日本、巴西及芬兰出现过暴发                ［6-7］ 。我国人      华大基因建库（≤800 bp常规文库）后上机进行细菌
                感染小肠结肠炎耶尔森菌以散发为主，但兰州和沈阳                           全基因组重测序，测序平台为BGI 2000。
                分别出现过两次大规模暴发             ［8-9］ 。因此，中国疾病预          1.2.4 毒力基因和MLST分析
                防控制中心在全国多省设立小肠结肠炎耶尔森菌监                                下 机 原 始 数 据 采 用 CLC genomics workbench
                测点。为了解江苏省小肠结肠炎耶尔森菌的表型和                            V20.0.4 软件（Qiagen）过滤并检查质量，运行 Micro⁃
                基因型特征，现对2016—2019年江苏省不同来源菌                        bial Genomics Module模块在NCBI数据库里进行5种
                                                                                                  ［6］
                株的血清、生物型、分子特征和同源性进行分析，探讨                          毒力基因（ail、ystA、ystB、yadA、virF） 比对及 MLST
                其分子流行病学特点及遗传进化关系，为本省小肠结                           鉴定  ［10］ 。确定 7 个等位基因序号构成的基因型（se⁃
                肠炎耶尔森菌病的长期监测和科学防控提供依据。                            quence type，ST），并将 7 个字符型数据导入 BioNu⁃
                                                                  merics 8.0（Applied Maths，Belgium）软件，利用非加
                1  材料和方法
                                                                  权配伍组平均法（unweighted pair group method with
                1.1  材料                                           arithmetic mean，UPGMA）进行聚类分析。
                    江苏省徐州的铜山区和盐城的东台市为小肠结
                                                                  2 结 果
                肠炎耶尔森菌国家级监测点，采集本地腹泻患者及家
                禽家畜粪便、生、熟肉制品等标本，4 ℃保存待检。                          2.1 菌株检出情况
                    改良磷酸盐缓冲液、麦康凯琼脂、改良克氏双                              2016—2019 年共采集各类标本 6 398 份，分离
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