Page 16 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 16
第42卷第5期
·612 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年5月
乳糖凝集素⁃3 抗体（Galectin⁃3，GAL⁃3，湖南艾方生 色（α⁃SMA，Gal⁃3，α1G，α1H，1∶200）按照常规方法
物科技有限公司）、羊抗鼠二抗（南京兰杰柯科技有 进行，每张切片滴加一抗溶液50 μL，次日滴加显色
限公司）、羊抗兔二抗（南京兰杰柯科技有限公司）； 剂DAB工作液50 μL观察显色。IHC阳性染色为棕
全蛋白提取试剂盒、BCA 蛋白浓度测定试剂盒（上 黄色。每个心脏样本取3个切片，在630×视野下随机
海碧云天生物技术有限公司）；核糖核酸（ribonu⁃cleic 选取5个视野，Image J计算心肌细胞横截面面积，纤
acid，RNA）反转录试剂盒、克隆用聚合酶链式反应 维化面积，及免疫组化染色面积阳性率，取平均值。
酶 LA Taq（南京诺唯赞生物科技股份有限公司）； 1.2.4 小 鼠 程 序 性 电 刺 激（programmed electrical
SYBR GREEN 实时定量 PCR 试剂盒（Invitrogen 公 stimulation，PES）
司，美国）；异丙肾上腺素（isoproterenol，ISO）、米贝 为了排除中枢生物钟通过自主神经系统对心
拉地尔（mibefradil，MIB）（Sigma公司，美国）。 脏电生理特性的调控，本部分采用小鼠离体心脏灌
1.2 方法 流条件下进行程序性电刺激诱发室性心律失常的
1.2.1 CHF造模及小鼠分组 发生。小鼠经过戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，开胸取
使用1%戊巴比妥钠，30 mg/kg腹腔注射麻醉小 出心脏，迅速置于4 ℃预冷生理盐水中，清洗残余血
鼠。小鼠仰卧姿势摆放于37 ℃预热的加热操作台， 液。分离主动脉，在主动脉中插入 7F 鞘管，将鞘管
脱去颈部及前胸部毛发并对裸露皮肤消毒处理，经 调整至主动脉内合适位置（主动脉瓣开口上方）固
口腔气管插管后连接小动物呼吸机，在胸骨上沿中 定，10 mL 注射器连接鞘管，用灌流液注射入心脏，
部偏左位置用剪刀小心开胸至第二肋骨位置，在第 排净心脏内血液，最后连于 Langendorff 灌流装。氧
一分支（无名动脉）和第二分支（左颈动脉）之间穿 饱和灌流液持续灌流，灌流速度控制为3 mL/min，温
以6⁃0号丝线并结扎于27 G的针头上，缩窄主动脉， 度控制为 37 ℃，并将心脏浸浴于灌流液中，两根心
假手术组（CON）做同样的处理但不结扎主动脉。术 电记录电极分别接在主动脉根部与心尖部，稳定灌
后4周行小鼠心脏超声评估心功能。选取CHF的小 流20 min，使心电图图形稳定。
鼠，予 TTCC 抑制剂米贝拉地尔（MIB）10 mg/kg/d 腹 起搏电极为银质双极起搏电极，将两电极分别
腔注射2周。分组如下：CON组：行假手术小鼠作为 置于左心室心尖部，极间距为 l mm。采用 200％阈
对照组，CHF组：主动脉缩窄手术心衰组，CHF+MIB 值的刺激强度，基础频率为 150 ms 的 S1⁃S1 刺激，
组：CHF小鼠腹腔注射MIB治疗组。 S1⁃S2间隔由起始的150 ms以每5 ms的幅度递减至
取样：自晚 6 点关灯起暗适应 36 h，后从晨 6 点 心脏不应期，Sl∶S2 为 8∶1，即 8 次 S1 刺激后 1 次 S2
起，每 4 h 取样 1 次，收取 48 h 左心室组织标本冻存 刺激。按心脏刺激程序直至重复使用3个连续期前
于-80 ℃冰箱，分别标记为CT（circadian time，CT）0、 刺激以确定是否能够诱发VA。
CT4、CT8、CTl2、CTl6、CT20、CT24、CT28、CT32、 1.2.5 蛋白免疫印迹法（Western blot）
CT36、CT40、CT44，供后续实验使用。 收集处理提取小鼠心脏组织，加入预冷的RIPA
1.2.2 小鼠心脏超声检测 裂解液提取组织总蛋白。常规 SDS⁃PAGE 凝胶电
小鼠心脏超声检测在江苏省人民医院公共实 泳、湿法转膜，5%BSA 溶液室温封闭 2 h，随后加入
验动物中心进行。使用仪器为配有 30 MHz 高频探 一抗（1∶1 000）置于 4 ℃冰箱孵育过夜。TBST 洗膜
头的 VisualSonic Vevo2100 型超声仪（VisualSonics 后加入二抗（1∶5 000），室温孵育2 h，洗膜后化学发
公司，加拿大）。在使用异氟烷麻醉小鼠后，沿仰卧 光显影，使用Image J图像分析软件分析蛋白相对表
小鼠胸骨旁左室乳头肌水平短轴和长轴切面采集 达量。
左室图像，同时在二维图像引导下分别获取 5 个以 1.2.6 实时定量逆转录聚合酶链反应（real⁃time
上连续心动周期M⁃mode 超声影像。根据采集影像 quantitative reverse transcription polymerase chain re⁃
使用软件分析结果，得到心超参数。 action，qRT⁃PCR）
1.2.3 心脏切片染色 采用TRIzol试剂按操作说明书提取心肌组织总
处死小鼠后，分离心脏标本，10%磷酸缓冲液福 RNA。根据试剂盒操作说明进行后续 qRT⁃PCR 扩
尔马林固定 24~48 h。HE 染色及 Masson 染色按照 增 ，采 用 Quantitation ⁃ comparative Ct（Livak）法 即
试剂盒说明书中的方法进行操作，普通光镜下观察 ΔΔCt 法测定进行数据分析。所有引物定制于上海
拍照。免疫组织化学（immunehistochemical，IHC）染 杰瑞生物工程有限公司。
