Page 64 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第6期
               ·816 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年6月


              少性紫癜（immune thrombocytopenia，ITP）和伴随血             物实验经由苏州大学动物管理和使用委员会批准。
              小板减少的骨髓异常增生综合征（myelodysplastic                         雷帕霉素（rapamycin，Rap）（Cell Signaling Tech⁃
              syndromes，MDS） 。因此，近年来自噬对巨核细胞                     nology，cat No.9904，美 国），山 羊 抗 兔 的 IRDye
                             ［2-3］
                                                      ［4］
              增殖分化和血小板生成的影响受到广泛关注 。                             800CW、山 羊 抗 小 鼠 的 IRDye 800CW 荧 光 二 抗
                  自噬是一个特殊的细胞代谢过程，能帮助细胞                          （LICOR Biosciences 公司，美国），FITC 标记的大鼠
              适应多种应激状态。细胞的自噬主要分为 3 种形                           抗小鼠的 CD41（Cat No.553848，BD Biosciences 公
              式：微自噬、巨自噬（简称自噬）和分子伴侣介导的                           司，美国），PE 标记的罗马尼亚仓鼠抗小鼠的 CD61
              自噬。巨自噬是通常意义上的自噬，它通过一个双                            （Cat No.12⁃0611，eBioscience 公司，美国），红外成像
              层膜的细胞器——自噬小体，将细胞内细胞器和胞                            系统（LI⁃COR Biosciences公司，美国）。
              浆内的组分重新利用          ［5-6］ 。自噬小体来源于膜状的              1.2  方法
              类似帽子结构的前体结构，在该结构的两极开始生                            1.2.1 原代巨核细胞的培养
              长，最终形成一个完整的封闭的充满胞浆和细胞器的                                断颈处死怀孕14.5 d的C57BL/6J小鼠，C57BL/6J
              细胞器。研究报道，自噬对巨核细胞和血小板的发育                           背景的CLEC⁃2基因敲除小鼠，用提前高温灭菌的直
              起重要作用     ［7⁃8］ 。例如在造血系统中特异性敲除自噬                  剪剖开孕鼠的腹部取出全部胚胎，放入提前预热的

              相关基因Atg7的自噬缺失小鼠（Atg7            flox/flox  Vav⁃Cre）巨  1×PBS 或者 DMEM 培养基至直径为 100 mm 的培养
                                                      ［9］
              核祖细胞数量大量减少并出现巨大血小板症 。进                            皿内，接着进行胎肝计数，分离胎肝。取完胎肝后进
              一步研究表明，这些小鼠的巨核细胞发育及血小板                            行胎肝单细胞悬液的制备。用 1 mL 的蓝色枪头小
              生成异常是源于细胞线粒体的功能障碍和细胞周                             心将胎肝连同培养基一起吸入孔径为 70 μm 的无
              期的阻滞     ［10］ 。另外，Mortensen 等 研究证实，在巨             菌细胞筛，研磨组织，反复研磨之后将培养皿内的
                                            ［9］
              核细胞和血小板上特异性敲除 Atg7 基因会导致小                         细胞悬液用新的无菌筛网过滤并收集至无菌50 mL
                    flox/flox  PF4⁃Cre 自噬缺失并且血小板的功能异            离心管内，制成单细胞悬液，400 g 离心 5 min，弃上
              鼠 Atg7
              常。由此可见，自噬在巨核细胞发育及血小板生成                            清。细胞的培养过程中还需在胎肝细胞获取的第
              中起到重要作用。                                          1 天添加细胞因子血小板生成素（thrombopoietin，
                  C型凝集素样受体⁃2（C⁃type lectin like receptor 2，     TPO）10 ng/mL。
              CLEC⁃2）是一个非经典型的 C 型凝集素受体，主要                       1.2.2 原代巨核细胞纯化
              表达在血小板和巨核细胞表面。研究表明，特异性                                 胎肝细胞用细胞因子连续诱导分化5 d（不换培
              敲除巨核细胞Syk基因的小鼠Syk             flox/flox PF4⁃Cre，其巨  养基），并在第 5 天用含 1.5% BSA 的 1×PBS 溶液密
              核细胞的成熟发育受到影响 。另外，Syk信号通路                          度梯度沉降法纯化已诱导成熟的巨核细胞。分别在
                                       ［11］
                                             ［12］
              已被证实参与巨核细胞的自噬过程 。而研究表明                            15 mL 无菌离心管内加上 1.5 mL 3% BSA 和 1.5 mL
              CLEC⁃2可以通过激活Syk信号通路激活Plcγ2，级联                     1.5%BSA 溶液，再将细胞培养基小心沿着管壁加在
              放大PKC信号通路，从而活化血小板               ［13-14］ 。为进一步     分离液的上面。细胞纯化时间为50 min~1 h，纯化完
              认识 CLEC⁃2 在体内调控巨核细胞自噬的作用，本                        毕后离心管的下部白色絮状沉淀即为成熟的巨核细
              研究使用 CLEC⁃2 缺陷小鼠，检测 CLEC⁃2 在调控自                   胞，不需离心只需将沉淀上方的培养基以及BSA溶液
              噬中的作用。                                            全部吸走即能得到巨核细胞进行后续的实验。
                                                                1.2.3 体外用药物上调细胞自噬
              1  材料和方法
                                                                     Rap 200 nmol/L 处理原代第 1 天获得的胎肝细
              1.1  材料                                           胞 5 d 或者 BSA 纯化之后的巨核细胞 6 h，对照组用
                  C57BL/6J（B6，CD45.2）小鼠、C57BL/6J 背景的            0.2% DMSO处理。
              CLEC⁃2基因敲除鼠购于苏州西山生物科技公司［动                         1.2.4 蛋白检测
              物质量合格证号为 SCXK（沪）2017⁃0012］。实验中                         巨核细胞或血小板用 1×PBS 离心洗涤之后，用
              使用的小鼠均在苏州大学无特定病原体（SPF）饲养                          新配制的含有蛋白酶和磷酸酶抑制剂的1×RIPA裂

              间养殖［动物饲养合格证号为 SYXK（苏）2017⁃                        解液进行冰上裂解30 min。细胞的蛋白浓度用BCA
              0043］。性别相同且同窝出生的野生型（WT）小鼠作                        试剂盒进行检测。每组样品的蛋白上样量为30 μg，
              为正常对照。实验小鼠均采用8~12周龄，所涉及动                          用 SDS⁃PAGE 胶电泳，纤维素膜转膜。转好的纤维
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