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第42卷第6期 姜 江，丁育红，贾 慧，等. 血小板受体C型凝集素样受体2在巨核细胞自噬中的作用［J］.
2022年6月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（06）：815-820 ·817 ·

素膜用 5%的脱脂牛奶在室温下封闭 1 h，并和一抗 A 巨核细胞 血小板
在 4 ℃摇床上孵育过夜，第 2 天将纤维素膜和山羊
ATG7 ←78 kDa
抗兔的 IRDye 800 CW 或者山羊抗小鼠的 IRDye
800 CW荧光二抗室温下共同孵育 1 h，红外成像系 ATG5 ←55 kDa
统观察目的条带。 LC3⁃Ⅰ ←14 kDa
LC3⁃Ⅱ
1.2.5 流式细胞术检测血小板表面蛋白 CD41 和 ←16 kDa
←42 kDa
CD61 Actin
上述分离出的胎肝巨核细胞加入 500 μL 的 1×
B 200
PBS，2 000 r/min离心5 min，再用100 μL 1×PBS 重悬 巨核细胞
血小板
全血，加入 FITC 标记的大鼠抗小鼠的 CD41 抗体
和 PE 标记的罗马尼亚仓鼠抗小鼠的 CD61 抗体各 （ % ） 150
0.5 μL，同时室温避光孵育40 min，再用1×PBS离心
洗去多余未结合的抗体并重悬细胞即可上机进行 蛋白相对表达水平 100
检测，并进行双阳性率分析比较。
1.2.6 小鼠骨髓的免疫荧光染色 50

野生型小鼠和CLEC⁃2敲除小鼠腹腔注射1 mg/kg
0
Rap，24 h 后腹腔注射 7%水合氯醛（5 μL/g）麻醉小 ATG7 ATG5 LC3
鼠，取出骨髓，立即置于 4%多聚甲醛中 4 ℃固定过 Western blot 显示野生小鼠胎肝细胞诱导的巨核细胞和洗涤血小
板中的 ATG7、ATG5、LC3⁃I 和 LC3⁃Ⅱ蛋白表达持续 5 d。A：Western
夜，将固定后的骨髓置于脱钙液中4 ℃过夜，PBS室温
blot 检测巨核细胞和洗涤血小板中各蛋白表达；B：蛋白表达半定量
摇洗，固定好的组织置于20%蔗糖中4 ℃脱水过夜， 分析结果（n=3）。
次日将组织用OCT包埋，迅速放置在平整的干冰上 图1 小鼠胎肝和骨髓来源的巨核细胞和血小板中的自噬基
冷冻，保存于-80 ℃备用。制备好的冰冻组织切块， 因表达
固定于冰冻切片机上，切成5 μm厚的冰冻切片，加入 Figure 1 Autophagy gene expression in mice fetal liver
标记的CD41和LC3抗体，共聚焦显微镜观察并拍照。 and bone marrow⁃derived megakaryocytes and
platelets
1.3 统计学方法
使用 Prism 6.0 软件进行统计分析。所有数据 达下调（图2）。
均来自至少3次独立实验。数据以均数±标准误（x ± 2.3 Rap 抑制胎肝细胞来源的 CLEC⁃2 缺陷巨核细
sx ）表示，使用 Graphpad 统计分析，当数据为 3 组或 胞CD41与CD61的表达
以上时使用 one way ANOVA。P < 0.05 为差异有统 CD41和CD61是造血干细胞向巨核细胞系定向
计学意义。 分化的特异高表达的膜表面糖蛋白。为了探究自
噬改变对巨核细胞分化的影响，流式细胞仪检测了
2 结 果
胎肝来源的巨核细胞表面 CD41 和 CD61 的表达。
2.1 自噬基因在胎肝来源的巨核细胞中的表达 结果表明，和野生型小鼠相比，200 nmol/L Rap 处理
成熟的巨核细胞可以通过原代胎肝细胞加入 的CLEC⁃2基因敲除小鼠巨核细胞CD41和CD61的
细胞因子体外诱导培养获得。本研究表明自噬重 双阳性率为（1.0 ± 0.1）%，显著下降（P < 0.01，图3）。
要相关基因ATG7、ATG5、LC3蛋白在胎肝来源的巨 2.4 Rap 增强 CLEC⁃2 缺陷巨核细胞骨髓自噬基因
核细胞中均有表达（图1）。 的表达

2.2 Rap 处理胎肝细胞能抑制巨核细胞 CLEC⁃2 的 小鼠腹腔注射Rap，24 h后取出小鼠骨髓，进行
表达 免疫荧光染色，结果表明，Rap能显著增强敲除小鼠
为探讨自噬紊乱是否影响胎肝来源的巨核细 LC3蛋白的表达，验证了CLEC⁃2的缺陷影响小鼠体
胞 CLEC⁃2 的表达，在分离胎肝细胞的第 1 天加入 内的自噬水平（图4）。
Rap与细胞因子TPO共同孵育培养5 d，诱导出巨核 2.5 Rap 抑制胎肝来源的 CLEC⁃2 缺陷巨核细胞的
细胞并通过流式细胞仪进行巨核细胞表面 CLEC⁃2 成熟
表达分析检测。Rap 导致胎肝巨核细胞 CLEC⁃2 表 巨核细胞成熟的一个标志性特征是发生核内