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第42卷第7期       王 莉，袁 逸，唐        艺，等. 宫内发育迟缓小鼠妊娠期胰岛lncRNA和mRNA的表达谱分析［J］.
                  2022年7月                     南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（7）：921-931                        ·923 ·


                定量 PCR 仪（Thermo Fisher 公司，美国）；Nano Drop               利用 lncRNA 与 mRNA 表达量的 Pearson 相关
                超微分光光度仪（Thermo Fisher公司，美国）。                      系数、RNAplex 等预测 lncRNA 的靶 mRNA，对靶
                1.2  方法                                           基因进行基因本体论（gene ontology，GO）功能注
                1.2.1  实验动物造模                                     释分析和京都基因与基因组百科全书数据库（Kyoto
                    8 周龄 C57B6/L 小鼠饲养在 SPF 级环境。待小                 encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通 路 富
                鼠适应环境后，傍晚雄性与雌性以1∶2合笼，次日清                          集分析。
                晨以阴道有精栓且阴道涂片发现精子为确定妊娠。                            1.2.4  实时荧光定量PCR
                    NP 组：自确定妊娠开始予以标准繁殖饲料（蛋                            逆转录反应按照 RT⁃PCR 试剂盒说明书进行。
                白含量为 20%）。IP 组：①IUGR 小鼠造模。孕鼠自                     将 AceQ qPCR SYBR Green Master Mix（High ROX
                确定妊娠开始予以低蛋白饲料（购自北京协同生物                            premixed）应用于 StepOne Plus 系统，进行 qRT⁃PCR
                有限公司，等热量、8%的蛋白质含量）至新生小鼠出                          反 应 。 反 应 体 系 20 μL：模 板 cDNA 1 μL，SYBR
                生；IUGR 小鼠造模成功标准：新生鼠体重低于同胎                         Green Master Mix 10 μL，上下游引物各0.4 μL，灭菌

                龄同性别小鼠体重的第 10 百分位点以下；②IUGR                        ddH2O 8.2 μL。引物序列如下，β⁃actin：上游 5′⁃
                雌小鼠 8 周成年后与同周龄雄鼠合笼，自受孕开始                          TGAGCTGCGTTTTACACCCT⁃ 3′，下游 5′⁃TTTGG⁃
                饲以标准繁殖饲料（蛋白含量为20%）。                               GGGATGTTTGCTCCA⁃3′；Neat1：上游 5′⁃CAAGAA⁃
                1.2.2  小鼠胰岛的提取                                    ACAGCAACACCAGAAG ⁃ 3′ ，下 游 5′ ⁃ TAAGGTC ⁃
                    NP、IP 孕鼠各 3 只，用 1%戊巴比妥钠麻醉后固                   CCCATTCAAGTCAGT⁃3′；FTX：上游 5′⁃AAGATC⁃
                定，剖开腹腔，分离穿刺胆总管，注入冷胶原酶消                            TCCGCTGCCAGATG⁃3′，下游 5′⁃CTGCTCCTGTGC⁃
                化、过细胞筛网，收集胰岛，放入 Histopaque1077 中                  CACGAATA⁃3′。反应条件：预变性 95 ℃ 5 min；
                纯化。所有胰岛均在显微镜下手挑计数。                                95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，40 个循环。根据熔解曲线判
                1.2.3  差异RNA检测分析                                  断引物的特异性及扩增效率，采用 2               -ΔΔCt 法对基因相
                    广州基迪奥生物科技有限公司使用RNA isolater                   对表达量进行计算和分析。
                Total RNA Extraction Reagent 裂解胰岛细胞，提取总           1.2.5  min6细胞的培养及不同糖浓度刺激
                RNA后使用Nano Drop超微分光光度仪进行RNA质检。                        小鼠胰岛细胞系 min6 细胞，其正常培养基
                    从总 RNA 中去除核糖体 RNA，以最大限度地                     （糖 浓 度 25 mmol/L）的 配 制 ：84% 的 高 糖 DMEM
                保留所有编码 RNA（coding RNA）和非编码 RNA                   （含 4.5 g/L 葡萄糖），15%胎牛血清（FBS），1%双抗
               （non⁃coding RNA，ncRNA）。得到的 RNA 随机打断               （100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素），0.035%的
                成为短片段，再以片断化后的 RNA 为模板，用六碱                         2.5 mmol/L β⁃巯基乙醇。细胞置于37 ℃、含5% CO2
                基随机引物（random hexamers）合成 cDNA 第 1 链；              培养箱中，每天更换新鲜培养基，融合度达 80%左
                接着加入缓冲液、dNTPs（dUTP 代替 dTTP）、RNase                 右进行传代。将高糖DMEM 替换成低糖DMEM（含
                H和DNApolymeraseⅠ合成cDNA第2链，经过QiaQuick              葡萄糖1 g/L），余成分不变，此时低糖完全培养基的
                PCR 试剂盒纯化并加 EB 缓冲液洗脱经末端修复、                        糖浓度为5.5 mmol/L，然后在10 mL低糖完全培养基
                加碱基 A，加测序接头，然后通过 UNG（uracil⁃N⁃                    中分别加入 0.01、0.02、0.05 g 葡萄糖粉，得到 11.1、
                glycosylase）酶降解第2条链。用琼脂糖凝胶电泳进                     16.7、33.3 mmol/L 不同糖浓度的培养基。将min6细
                行片段大小选择，进行PCR扩增。最后建好的测序                           胞接种于6孔培养板中，待细胞贴壁后，加入无糖低
                文库用Illumina⁃HiSeq 4000进行测序。                       血清（0.25%）培养基培养6~8 h后弃去，分别加入不
                                   TM
                    对下机数据进行过滤得到clean data后，将reads                 同糖浓度培养基2 mL，标记好糖浓度，放入37 ℃、含
                用 Tophat2（2.1.1）比对到小鼠参考基因组（ensemble               5% CO2培养箱中，24 h后收RNA。
                104）上，并利用Cufflinks重构转录本，得到已知转录                    1.3  统计学方法
                本与新转录本。利用CPC、CNCI等软件对新转录本                             使用 Graphpad Prism 8.4.3 软件绘制实验结果
                进行编码能力预测，得到新预测的lncRNA。然后分                         图，基因表达量以均值±标准差（x ± s）表示，两组间
                别对样本中的 mRNA、lncRNA 进行表达量分析，并                      比较采用独立样本 t 检验，多组间比较采用单因素
                使用 edgeR 包对组间 lncRNA 和 mRNA 进行差异分                 方差分析（one⁃way ANOVA）。P < 0.05 为差异有统
                析。|log2FC|>1，P < 0.05表示有差异。                       计学意义。
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