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第42卷第7期 陈晓超，卜恒涛，梁 超，等. m5C甲基化相关基因预测肾透明细胞癌的预后［J］.
2022年7月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（7）：983-993 ·985 ·

筛选出来的 13 个 m5C 甲基化相关基因进行共识聚 预后价值。
类分析。此外，还对不同的聚类进行生存分析，以 1.2.6 GO和KEGG富集分析
确定肾透明细胞癌样本中的最佳聚类。然后进行 使用 R 软件包“clusterProfiler”、“enrichplot”和
了 Kaplan⁃Meier 生存分析，以揭示不同集群之间 “ggplot2”对这13个选定基因进行GO 和KEGG 富集
总体生存率的差异。比较临床病理参数，包括 分析，以确定分子功能（molecular function，MF）、细
性别、分级、年龄、TNM 分期和不同聚类之间的 胞成分（cellular components，CC）和生物过程（biolog⁃
关系。 ical process，BP）并寻找潜在的信号通路。
1.2.4 蛋白质相互作用及功能分析 1.2.7 细胞培养

为了进一步筛选出中心基因，使用 STRING 肾癌细胞系（786⁃O、A498）和人肾小管上皮细
数据库检索相互作用基因以分析差异表达的 m5C 胞系（HK⁃2）均购自中国科学院（上海）细胞库。其
甲基化相关基因，构建蛋白质⁃蛋白质相互作用 中，786⁃O 和 HK⁃2 细胞在 RPMI 1640 中培养，A498

（protein⁃protein interaction，PPI）网络（http：//string⁃ 细胞在DMEM/F12中培养。所有细胞系均在37 ℃、
［12］
db.org/） 。 含5% CO2的培养箱中培养。
1.2.5 构建预测模型 1.2.8 总RNA的提取和qRT⁃PCR
首先，计算危险比（hazard ratio，HR，危险组个 使用 TRIzol 试剂（美国赛默飞公司）从培养的

体和非危险组个体的比值）和 95%置信区间（confi⁃ 细胞和组织样本中提取总 RNA，并将其反转录为
dence interval，CI），通过单变量Cox回归分析识别适 cDNA。 然 后 使 用 StepOne Plus 实 时 PCR 系 统 和
当的候选基因。其次，使用 Lasso⁃Cox 回归分析，挑 SYBR Premix Ex Taq 试剂进行 qRT⁃PCR 实验，目的
选出合适的能够预测肾透明细胞癌的预后基因，风 基因引物见表1。
n 1.3 统计学方法
险值计算公式为：风险值=∑coef×xi （其中，n 代表
i=1 统计分析使用 R 软件（4.1.0）进行。此外，Perl
mRNA 的数目，coef 是系数，xi 是基因的表达量）。 编程语言（版本5.30.2）用于数据处理。Kaplan⁃Meier
接下来，根据风险值中位数，将 TCGA 的肾透明细 生存曲线分析用于分析总体生存率（overall survival，
胞癌队列分为高风险组和低风险组，再用 Kaplan⁃ OS）。单变量和多变量 Cox 回归分析用于评估预后
Meier生存分析/风险预测模型估计候选风险基因的 意义。P < 0.05为差异有统计学意义。

表1 实时定量PCR的引物序列
Table 1 The sequences of primers for RT⁃qPCR
目的基因 正向引物（5′→3′） 反向引物（5′→3′）
GAPDH GAAGGTGAAGGTCGGAGTC GAAGATGGTGATGGGATTTC
NSUN5 AGTGGCGGAGACTGTAAGG GGCAATGGAATGGCTAAA
NSUN6 AATAATGGCGAGGGTCTT GTTGGGCTAATGGTCTGT
DNMT3B CTTCTTGTTCACCCACCTT CCCACTGCCTCTTTACCC
TET2 TCTGAGGGTAAGGTGGGC GAGGTGGGAGGTTGGGAT

达（P < 0.05）。其中包括 NOP2、NSUN2、NSUN3、
2 结 果
NSUN4、NSUN5、NSUN6、NSUN7、DNMT1、DNMT3A、
2.1 m5C 甲基化相关基因在肾透明细胞癌中的表 TET2、DNMT3B 以及 ALYREF。然而，与正常组织
达情况 相比，肾透明细胞癌组织中 TRDMT1 的表达没有明
为了明确肾透明细胞癌中 m5C 甲基化相关基 显差异（图 1B）。在这 12 个基因中，除了 NSUN4 和
因的基本生物学功能的表达，首先从 TCGA 数据库 NSUN7外，其余基因在肿瘤组织中表达较正常组织
中下载并提取了有效的基因表达数据，如热图所示 明显上调（P < 0.05）。说明 m5C 甲基化相关基因在
（图1A）。在572例肿瘤患者中，13个m5C甲基化相 肾透明细胞癌组织和相应的正常组织中的表达有
关基因中有 12 个在肿瘤和正常组织中有差异性表 明显差异。