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第42卷第7期
               ·988 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年7月


              2.4  生存预后模型的构建                                    DNMT3B 的表达量和拷贝数变异之间的 Pearson 系
                  为了研究 m5C 甲基化相关基因在肾透明细胞                        数分别为 0.36、0.13、0.30、0.34（图 5），我们认为
              癌预后中的作用，对 13 个 m5C 甲基化相关基因表                       TET2、NSUN5、DNMT3B 可能是由于其拷贝数的变
              达谱进行了单变量 Cox 回归分析。结果显示，有 4                        异而对肾透明细胞癌的发生和进展产生影响。
              个基因（NSUN5、NSUN6、DNMT3B、TET2）可以用来                  2.7  4个模型基因对肾透明细胞癌预后产生影响的
              预测肾透明细胞癌的预后（图 3A）。在这 4 个基因                        可能途径
              中 ，TET2 是 HR < 1 的 保 护 基 因 ，而 NSUN5、                   通过limma软件包筛选出336个差异表达基因，
              NSUN6、DNMT3B 是 HR > 1 的风险基因。然后将                   其中 281 个上调（P < 0.05，log2FC > 1），55 个下调
              筛选出的基因应用 Lasso⁃Cox 回归建立生存预后                       （P < 0.05，log2FC < -1），使用 GOplot 和 ggplot2 软件
              模型，根据最低标准生成了单个候选基因的系数                             包进行了GO和KEGG富集分析，以说明差异表达基
             （图 3B）。随后，TCGA 数据库中每个肾透明细胞癌                        因的功能。KEGG分析结果显示：在高风险组中，这

              患者的风险值计算：0.258 493×NSUN6 表达量+                     些差异表达基因的功能主要与补体和凝血级联相
              0.058 203×NSUN5 表达量+（-0.502 707）×TET2 表           关（P < 0.05），而在低风险组中，则主要与癌症中的
              达量+0.070 293×DNMT3B表达量（图3C）。之后，根                  蛋白聚糖相关（P < 0.05，图6A、B）。GO分析结果显
              据风险值中位数界限，肾透明细胞癌患者被分成高                            示：在高风险组中，这些差异表达基因在生物过程
              风险组和低风险组，高风险组患者生存率显著低于                            方面主要与体液免疫反应和水解酶活性的负调控
              低风险组（图3D）。这些结果表明，这4个m5C甲基                         相关（P < 0.05），在细胞成分方面主要与血液微粒相
              化相关基因可以作为肾透明细胞癌的预测基因。                             关（P < 0.05），在分子功能方面主要与酶抑制剂活性
              2.5  生存预后模型与肾透明细胞癌临床特征的相                          相关（P < 0.05）；而在低风险组中，这些差异表达基
              关性                                                因在生物过程、细胞成分和分子功能方面分别与对
                  热 图 显 示 ，TET2 在 低 风 险 组 中 高 表 达 ，而            类固醇激素的反应、含胶原蛋白的细胞外基质和碳
              NSUN5、NSUN6 和 DNMT3B 在高风险组中高表达。                   水化合物的结合相关（P < 0.05，图 6C、D）。这些结
              此外，T、M 分期和分级存在显著差异（图 3E，P <                       果为我们寻找 m5C 甲基化相关基因在肾透明细胞
              0.05）。进一步运用单变量 Cox 回归分析确定预后                       癌中的潜在功能提供了新的途径。
              因素。结果显示：年龄（P < 0.001，HR=1.03，95%CI：               2.8  4种m5C甲基化相关基因在肾透明细胞癌细胞
              1.017~1.044），分级（P < 0.001，HR=2.302，95%CI：         系及组织样本中的表达
              1.858~2.851），分期（P < 0.001，HR=1.926，95%CI：              为了进一步验证4个选定的模型基因在肾透明
              1.678~2.209），T（P < 0.001，HR=1.987，95% CI：         细胞癌和组织样本中的mRNA 表达情况，本研究在
              1.674~2.357），N（P < 0.001，HR=1.856，95% CI：         肾透明细胞癌细胞系和组织样本中进行了 qRT⁃
              1.528~2.255），M（P < 0.001，HR=4.388，95% CI：         PCR实验。结果显示：与人肾小管上皮细胞系（HK⁃
              3.178~6.06）为 单 变 量 分 析 的 独 立 预 后 因 素（图            2）和癌旁正常组织相比，肾癌细胞系（786⁃O、A498）
              3F）。再对这些参数进行多变量Cox回归分析，有价                         和肾透明细胞癌组织样本中的 NSUN5、NSUN6、
              值的因素包括年龄（P < 0.01，HR=1.034，95%CI：                 TET2、DNMT3B表达水平显著上调（图7）。
              1.018~1.049），分级（P < 0.001，HR=1.549，95%CI：
                                                                3 讨     论
              1.218~1.968），分 期（P=0.027，HR=1.689，95% CI：
              1.062~2.689，图3G）。                                      本研究首先分析了这 13 个 m5C 甲基化相关基
              2.6  4个模型基因在泛癌中的表达及其在肾透明细                         因在肾透明细胞癌中的表达情况，结果显示，NOP2、
              胞癌中的遗传变异                                          NSUN2、NSUN3、NSUN4、NSUN5、NSUN6、NSUN7、
                  为了明确上述4个基因在人类相应肿瘤中的表                          DNMT3A、DNMT3B、TET2和ALYREF在肾透明细胞
              达差异，在泛癌样本中对这 4 个基因的转录水平进                          癌组及正常组中差异表达。其中，除了 NSUN4 和

              行比较，结果表明，TET2、NSUN5、NSUN6、DNMT3B                  NSUN7 外，其余基因在肿瘤组中均高表达。接下
              在人类肿瘤中几乎均是过表达（图 4A~D）。此外，                         来，根据m5C甲基化相关基因将肾透明细胞癌患者
              在 cBioportal 数据库中研究了这 4 种基因与拷贝数                   样本分为两个亚群，分析显示，亚群1中肾透明细胞
              变异之间的关系，结果显示：NSUN5、NSUN6、TET2、                    癌患者总体生存率较亚群 2 低，这预示着 m5C 甲基
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