Page 60 - 南京医科大学学报自然科学版
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第42卷第8期
               ·1102 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2022年8月


              1.2.4 细胞转染                                        胞的实验都至少重复 3 次。所有数据以平均值±标
                  lncRNA RAD51⁃AS1 的 Smart Silencer 以用于干        准差（x ± s）表示。组间差异用双尾 Student’s t 检
              扰 RAD51⁃AS 的表达，其中使用无酶超纯水对 RNA                     验。P < 0.05为差异有统计学意义。
              干粉进行稀释。Lipofectamine 3000和100 nmol/L的
                                                                2  结 果
              Smart Silencer 在 1 个试管中孵化，转染 15 min。转
              染6~8 h后，更换新的细胞完全生长培养基，待培养                         2.1  筛 选 差 异 基 因（differentially expressed gene，
              至24~72 h后进行后续实验。                                  DEG）和富集分析
              1.2.5 MTT实验                                            本 研 究 中 ，从 GEO 数 据 库（https：//www.ncbi.
                  ①将转染 24~36 h 的细胞消化下并计数，每孔                     nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE35956）下载表
              3 000 个细胞；②待细胞贴壁完全后，每孔加入浓度                        达矩阵。利用其原发性OP的基因芯片，整理得到5

              为 5 mg/mL 的 MTT 工作液 20 μL，37 ℃孵育 4 h；③            例正常人及 5 例原发性 OP 患者，且年龄较为相近。
              加入 DMSO 溶解所形成的紫色结晶，使用酶标仪测                         随后对芯片数据进行处理，使用DEseq2且根据|log2
              得每孔在490 nm处的吸光度值，分析不同处理的条                         Fold Change|＞1，P＜0.05的条件下，筛选出1 440个

              件培养基对细胞活力和生长的影响；④连续测量5 d                          DEG，其中 1 161 个上调 DEG，279 个下调 DEG（图
              吸光度，进行结果分析。                                       1A）。
              1.2.6 克隆形成实验                                           根据京都基因与基因组百科全书（Kyoto Ency⁃
                  取对数生长期的各组细胞，分别用 0.25%胰蛋                       clopedia of Genes and Genomes，KEGG）数据库和基
              白酶消化并吹打成单个细胞，并把细胞悬浮在完全                            因本体论（gene ontology，GO）分析的结果，本研究
              培养液中备用。将细胞悬液稀释，每组细胞分别以                            以 P 调整＜0.05 为筛选条件，并按照富集于此通路的
              1 500个/孔接种在含2 mL 37 ℃预温培养液的6孔板                    DEG 计数值从大到小排列。KEGG 结果显示，这些
                                                                DEG主要富集于神经活性配体与受体的相互作用、
              中，并轻轻转动，使细胞分散均匀。置37 ℃ 5% CO2
              及饱和湿度的细胞培养箱中培养2周。经常观察，当                           PI3K⁃Akt 信号转导途径及 cAMP 信号转导途径等
              培养皿中出现肉眼可见的克隆时，终止培养。弃去                            （图 1B）。而在 GO 分析的生物学过程（biological
              上清液，用PBS小心浸洗2次。加4%多聚甲醛固定                          progress，BP）中，这些DEG主要参与单核细胞分化、
              细胞 15 min。然后去固定液，加适量结晶紫染液染                        淋巴细胞分化、Ⅰ型干扰素信号转导通路、细胞对
              20~30 min，然后用 PBS 洗去染色液，空气干燥。将                    Ⅰ型干扰素的响应、对Ⅰ型干扰素的响应和对病毒
              大皿倒置并叠加一张带网格的透明胶片，用肉眼直                            基因组复制的负向调节；从分子功能上看，这些
              接计数克隆，或在显微镜（低倍镜）计数＞10个细胞的                         DEG主要涉及受体配体活性、信号受体激活剂的活
              克隆数。最后计算克隆形成率。                                    性、通道活性、被动跨膜转运器活性、离子通道活
              1.2.7  诱导成骨分化                                     性、门控通道活性及细胞因子活性等（图1C）。
                  为了进行成骨细胞分化，hBMSC在成骨细胞分                        2.2  lncRNA重注释后筛选DEG
              化培养基（α⁃MEM，含 5% UltraGRO、1 μmol/L 地塞                   从GEO数据库中找到GSE35956基因芯片表达
              米松、10 mmol/L β⁃甘油磷酸酯、50 μmol/L 抗坏血                矩阵，为了研究OP中差异表达的lncRNA。根据以前

              酸、100 U/mL 青霉素和 100 U/mL 链霉素）中培养 0~               的论文，在 GPL570 平台芯片上进行了 lncRNA 的重
                                                                      ［9］
              7 d。每3 d更换1次培养基。                                  新注释 ，注释后发现了1 228个 lncRNA。随即使用
              1.2.8  ALP染色实验                                    DEseq2对lncRNA进行差异基因分析，根据|log2 Fold
                  在成骨诱导第 5 天进行 ALP 染色。用 4%多聚                    Change|＞1，P 调 整 ＜0.05 的条件下，筛选出 105 个
              甲醛固定细胞30 min，用PBS洗2~3次，然后与适量                      DEG，其中68个上调DEG，35个下调DEG（图2）。
              的 BCIP/NBT 染色液混合，对 hBMSC 进行染色。将                   2.3  在正常人及 OP 患者的 hBMSC 中验证 RAD51⁃
              hBMSC 在室温下染色 20~30 min，观察其染色程度                    AS1的表达，并沉默RAD51⁃AS1的表达
              达到预期后，除去工作液，用ddH2O清洗2次以停止                              在lncRNA的DEG中，lncRNA RAD51⁃AS1未有
              反应。                                               过相关报道其与 OP 的关系。收集 10 例正常人及

              1.3  统计学方法                                        10 例 OP 患者的骨髓血，并从中提取 hBMSC 验证
                  实验数据皆用SPSS17.0软件分析，每个涉及细                      RAD51⁃AS1的表达量。经过实时定量PCR验证，发
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