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第42卷第8期 李北辰，徐芳蓉，杨崇正，等. lncRNA在骨质疏松中作用的初步研究［J］.
2022年8月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（08）：1100-1106 ·1101 ·

骨质疏松症（osteoporosis，OP）是由于多种原因 映射到 lncRNA 的探针集。首先，从 Affymetrix 网站
导致的骨密度和骨质量下降，骨微结构破坏，造成 下载了 HG⁃U133 Plus 2.0 微阵列探针注释，以过滤
骨脆性增加，从而容易发生骨折的全身性疾病 ［1-2］ 。 具有 Refseq ID 的探针集，标记为“NR_”或“XR_”。
OP 引起的骨折人数的增加及其相关发病率给公共 第二，将 GSE35956 矩阵与上述文件中的探针 ID 结
卫生服务行业带来了沉重负担 ［2-3］ 。因此，寻找有效 合起来。第三，利用 Genecode 数据库将步骤 2 文件
的OP预防和治疗策略，在目前仍是一个关键问题。 与有基因名的注释文件相结合。最后，总共选择了
在多种因素的调节下，骨形成和骨吸收的过 特定的 1 228 个有注释的 lncRNA 转录物和相应的
［9］
程保持动态平衡，以维持骨内环境的稳态。一方 Affymetrix 探针ID 。微阵列分析GSE35956原始数
面，众多信号通路参与到骨平衡中，如 Wnt/β⁃FGF、 据从 GEO 数据库下载（GSE35956）。数据微阵列的
PI3K⁃Akt及BMPs/Smads等信号通路。另一方面，非 背景校正和归一化由 R 语言的 AffyR 包处理。此
编码 RNA 的表观遗传调节也在骨平衡中发挥重要 外，在归一化表达的基础上，用 R 软件生成特异的
作 用 。 长 链 非 编 码 RNA（long non⁃coding RNA， 1 228 个 lncRNA 表达矩阵。mRNA 和 lncRNA 差异
lncRNA）参与各种人类疾病的生物学过程 ［4-5］ 。 基因表达分析由DEseq2 R包进行。使用ggplot R软
lncRNA在表观遗传学、转录以及转录后水平广泛参 件包在 dif⁃lncRNA 上绘制火山图。使用 ClusterPro⁃
与，可以顺式或反式作用的方式调节组蛋白修饰、染 filer 对 mRNA 差异分析的基因进行富集分析。
色质重塑、蛋白质功能活性及RNA代谢 ［6-7］ 。所以， 1.2.2 细胞提取和培养
发掘出关键的信号通路和有意义的lncRNA，可以为 从骨髓中吸取骨髓血后立即加入无菌的α⁃
诊断和治疗OP提供新视角。 MEM 进行运输。无菌条件下使用密度梯度离心法
本课题组通过利用GEO数据库，对GSE35956基 分离出人骨髓间质干细胞。人骨髓间充质干细胞
因芯片进行分析，使用富集分析和lncRNA重注释的 需要培养在含有5% UltraGRO 的α⁃MEM 培养基中，
方法，发掘出其中关键的信号通路和lncRNA RAD51⁃ 贴壁生长；同时根据需求是否添加双抗（100 mg/L链
AS1。而且，通过细胞学实验验证 RAD51⁃AS1 促进 霉素和100 U/mL）。细胞常规培养在含有5% CO2的
增殖及成骨的能力，对 RAD51⁃AS1 改善 OP 进行了 37 ℃恒温培养箱中，每3~4 d更换新的培养基，当培
初步研究，为未来OP的诊治提供新思路 。 养皿中细胞融合度达到 80%~90%时，按 1∶2 或 1∶3
［8］
的比例进行细胞传代。后续使用正常人的骨髓间
1 材料和方法
充质干细胞继续功能试验。
1.1 材料 1.2.3 实时定量PCR
骨髓间充质干细胞从正常人及确诊 OP 的志愿 提取骨髓间充质干细胞的总RNA，根据美国国
者的骨髓血提取。所有的骨髓血取下后立即置于 家生物信息中心（National Center for Biotechnology
完全培养基中，并及时提取其中骨髓间充质干细 Information，NCBI）提供的基因序列，设计并合成lnc⁃
胞，培养至第 2 代后提取样本的总 RNA。本课题研 RNA RAD51⁃AS1 和内参 ACT⁃β的引物。RAD51⁃
究通过了南京医科大学附属南京医院伦理委员会 AS1上游引物：5′⁃TGATCCTGCGCGAGTTTACA⁃3′，下
的同意，并得到了所有取样患者的知情同意。 游引物：5′⁃ATGCATGCCGGGAGATGTAG⁃3′；ACT⁃β
培养细胞的α⁃MEM培养基、TRIzol 试剂及转染 上游引物：5′⁃TCTCCCAAGTCCACACAGG⁃3′，下游

试剂 Lipofectamine 3000（Invitrogen 公司，美国）；Ul⁃ 引物：5′⁃GGCACGAAGGCTCATCA⁃3′。实时荧光定
traGRO（上海Helios BioScience公司）；逆转录及实时 量PCR反应体系20 μL，其中包括：ddH2O 7.2 μL、上

定量PCR试剂盒（南京诺唯赞公司）；lncRNA RAD51⁃ 游引物（10 μmol/L）0.4 μL、下游引物（10 μmol/L）
AS1的Smart Silencer（广州锐博公司）；MTT（Biofroxx 0.4 μL、SYBR Green 10.0 μL及模板cDNA 2.0 μL，每
公司，德国）；ALP染色试剂盒（上海碧云天公司）。 个样本设置2~3个复孔。反应条件：第1阶段对cDNA

1.2 方法 进行预变性，在 PCR 中 95 ℃，30 s；第 2 阶段进行循
1.2.1 lncRNA重注释及生物信息学分析 环反应进行扩增，在 95 ℃下 10 s，60 ℃下 30 s，循环
GSE35956 数 据 集 使 用 了 Affymetrix HG ⁃ 40 次；最后阶段对最终产物进行熔解曲线测量，
U133Plus 2.0 微阵列，包括 54 675 个探针组。根据 95 ℃下 15 s，60 ℃下 60 s 和 95 ℃下 15 s。基因表达
既往文献，对基因芯片进行lncRNA 重注释，以确定 分析是通过2 -ΔΔCT 方法计算的。