Page 78 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第8期
·1120 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年8月

［9］
肿瘤蛋白 53（tumor protein 53，TP53）是最重要 时，Cas13a的RNA酶特性被抑制 。
的抑癌基因之一，其编码蛋白 P53 是胞内关键的转 本 研 究 利 用 Over ⁃ lap PCR 技 术 ，构 建 TP53
录因子，能够调控P21、Bcl⁃2相关X蛋白（BCL2 asso⁃ R248W变异体质粒作为检测对象，设计特异性的靶
ciated X，BAX）等多种靶基因的表达水平，广泛参与 标 crRNA，并根据 Cas13a 蛋白的‘连带剪切’特性，
DNA 损伤修复、细胞凋亡、细胞周期调控等多种重 实现对 TP53 基因 R248W 突变的快速检测，以期建
要进程 。TP53 功能获得性突变常导致其抑癌功 立新的、快速、简便以及灵敏的肿瘤驱动基因检测
［1］
能 的 丧 失 ，如 R273H、R175H、R248W 等 ，其 中 方法，为肿瘤的治疗及监控提供帮助。
R248W突变不仅导致其抑癌功能丧失，还能够促进
1 材料和方法
肿瘤恶性表型和侵袭，导致患者预后较差，而有研
究发现阿霉素对携带TP53 R248W突变的患者治疗 1.1 材料
更为敏感 ［2-3］ 。因此，对 TP53 R248W 变异体的检测 Cas13a 蛋白（M20201）、FAM 荧光探针（H2001⁃
不仅有助于预警肿瘤的发生发展，还能指导肿瘤的 2023）和本研究设计的crRNA 购自于广州博徕斯生
治疗和用药。目前，组织和血浆中 TP53 R248W 的 物公司，所设计扩增引物由威海四合生物公司合
检测手段主要有数字 PCR、高通量测序、突变扩增 成，具体序列见表1。T7转录酶试剂盒（JT101⁃01）、
系统等。数字 PCR 准确度高，但成本高，对仪器和 高保真 DNA 聚合酶（AP231⁃13）、RNA 酶抑制剂
操作人员要求高；高通量测序灵敏度高但实验流程 （AI101⁃01）（北京全式金生物）。Top10 感受态细胞
复杂；突变扩增系统操作简单但稳定性欠佳，所以 （B528412）（上海生工生物工程公司）。RAA试剂盒
亟需寻找一个新的灵敏度高、稳定性好及成本低的 （TABAS03KIT）（TwistDx 生物公司，英国）。T4 连接
肿瘤驱动基因检测方法 。 酶（6022Q）、XhoⅠ限制酶（1094S）及 KpnⅠ限制酶
［4］
成簇的规律间隔的短回文重复序列（clustered （1068S）（TaKaRa 公司，日本）。血浆DNA 提取试剂
regularlyinterspacedshortpalindromicrepeats，CRISPR） 盒（D3182 ⁃ 03C）（Magen 生 物 公 司 ，美 国）。 ABI
及其相关蛋白是近年来火爆的研究热点，在RNA干 9700 PCR仪（赛默飞公司，美国）。荧光检测仪（Bio⁃
扰和基因编辑等领域有着巨大的潜力 。其中， Rad 公司，美国）。TP53 野生型质粒、pENTER 空载
［5］
CRISPR 相 关 蛋 白 13a（CRISPR ⁃ associated protein 体由本课题组实验室提供。
13a，Cas13a）是一种新发现的Ⅱ类、Ⅵ型Cas 效应蛋 1.2 方法
白，其活性由高等真核生物和原核生物核苷酸结合 1.2.1 TP53 R248W标准品的构建
（higher eukaryotes and prokaryotes nucleotide ⁃ bind⁃ 以野生型TP53质粒为模板，使用TP53⁃F&Rm和
ing，HEPN）结 构 域 决 定 ［6］ 。 与 Ⅱ 型 Cas9 不 同 ， Fm&TP53⁃R两对引物分别扩增TP53 R248W突变位
Cas13a 属于 RNA 酶分子，在 CRISPR RNA（crRNA） 点前后段序列，使扩增前后段序列均携带有 R248W
的引导下，Cas13a 结合靶 RNA，激活 HEPN 结构域， 点突变，然后进行重叠（Over⁃lap）PCR将上述两个片
从而特异性水解靶RNA 及‘连带剪切’周围RNA 分 段融合。融合产物经限制酶 XhoⅠ和 KpnⅠ双酶切
子 ［7⁃8］ ，但当 Cas13a/crRNA 复合物与非靶 RNA 结合 后，使用 T4 连接酶将它与 pENTER 载体进行连接。
表1 突变株的构建引物、RAA引物、crRNA序列和探针序列
Table 1 Mutant strain primer，RAA primer，crRNA sequence and probe sequence
名称 序列（5′→3′）
TP53⁃F ACACCCGGGGTACCGATTCCTCACTGATTGCTCTTA（KpnI位点）
TP53⁃R ACCCACCGCTCGAGAGTAACACCATCGTAAGTCAAG（XhoI位点）
Fm CCTGCATGGGCGGCATGAACTGGAGGCCCATCCTCACCATCATCACA（R248W突变）
Rm TGTGATGATGGTGAGGATGGGCCTCCAGTTCATGCCGCCCATGCAGG（R248W突变）
R248W⁃RAA⁃F ATATTTAATACGACTCACTATAGGGGTTGGCTCTGACTGTACCACCATCCACTAC
R248W⁃RAA⁃R1 CTGGAGTCTTCCAGTGTGATGATGGTGAGG
R248W⁃RAA⁃R2 ATCTACTCCCAACCACCCTTGTCCTTTC
R248W⁃crRNA GATTTAGACTACCCCAAAAACGAAGGGGACTAAAACCCACTTCATGCCGCCCATGCAGGAACTG
（碱基A为R248W突变，碱基C为引入突变）
Probe 5′⁃FAM⁃UUUUUU⁃3′⁃BHQ1