Page 81 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第8期 邝振展，肖 斌，孙朝晖，等. 基于CRISPR/Cas13a技术检测肿瘤驱动基因TP53 R248W的研究［J］.
2022年8月 南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（08）：1119-1124 ·1123 ·

2 000 Wild type A 0 1 2 3 4 5
*** 0 1×10 1×10 1×10 1×10 1×10 1×10 M
R248W 2 000 bp
***
1 500
1 000 bp
RFU 1 000 750 bp
500 bp
250 bp
500
100 bp
0
B
0.05 0.1 0.15 0.20 0.25 4 000
crRNA（μmol/L）
**
两组比较， P < 0.001。 3 000
***
图 3 不同浓度crRNA对CRISPR/Cas13a检测强度的影响
Figure 3 The effect of different crRNA concentrations for RFU 2 000 **
CRISPR/Cas13a detection
1 000
A
M 10.00%1.00% 0.10% 0.01% 0% 0
0
2
3
4
1
0 1×10 1×10 1×10 1×10 1×10 1×10 5
2 000 bp
浓度（copies/μL）
1 000 bp A：血浆ctDNA的扩增结果电泳图；B：CRISPR/Cas13a方法对模
**
750 bp 拟血浆ctDNA的检测结果。两组比较，P < 0.01。
图5 CRISPR/Cas13a对模拟血浆ctDNA的检测
500 bp
Figure 5 CRISPR/Cas13a detection to mimic plasma
250 bp ctDNA
100 bp 本研究设计了两对扩增引物Primer1和Primer2，
B 其扩增产物长度分别为110 bp和368 bp。结果显示
4 000 ***
***
*** CRISPR/Cas13a 技术不能检测 Primer1 的扩增产物，
3 000
*** 而可以有效检测 Primer2 的扩增产物，说明靶 RNA
RFU 2 000 长度可能影响 CRISPR/Cas13a 的的检测效能，推测
是较短的靶标 RNA 与 Cas13a/crRNA 形成的复合物
1 000
所获得的自由能不能激活Cas13a的RNA酶活性 。
［15］
0 为了探究不同扩增方法对CRISPR/Cas13a技术
0 0.01 0.10 1.00 10.00
突变频率（%） 的影响，本研究使用了 PCR 和 RAA 两种扩增技术。
A：CRISPR/Cas13a方法对不同TP53 R248W突变频率的检测结 结果表明CRISPR/Cas13a检测结果没有因扩增方法
果；B：扩增产物的电泳结果。两组比较， P < 0.001。 不同而显示出差异。一般而言，RAA方法不需要专
***
图4 CRISPR/Cas13a对不同突变频率TP53 R248W的检测 用的仪器，实验时间短，大多30 min内可完成扩增，
Figure 4 CRISPR/Cas13a detection to different mutation
frequency of TP53 R248W 但目前测试价格比较昂贵；PCR 需要专用的 PCR
仪，实验所需时间长，但价格相比 RAA 便宜 ［16］ 。目
对 Cas13a 蛋白、RNA荧光探针及侧向层析试纸的联 前，肿瘤驱动基因检查对结果报告时间没有太高的要
合使用，成功对登革热或和寨卡病毒单链RNA进行 求，因此扩增技术可以选用更为便宜的PCR方法。
了检测。Fozouni 等 ［14］ 为提高 Cas13a 蛋白对 SARS⁃ 据报道，crRNA的间隔序列在重复序列的3′端，
CoV⁃2 病毒核酸检测的灵敏度，在同一反应中使用 且长度为28 nt时，功能发挥最佳 ［17］ ，因此，本研究的
多个crRNA，并且通过一个手持小型设备，实现快速 crRNA间隔序列也设计在重复序列的3′端且长度为
便携地获取结果。Ke 等 ［15］ 为降低 Cas13a 蛋白的脱 28 nt，并通过 CRISPR/Cas13a 检测结果证实了这一
靶效应，在 crRNA 的 3′末端添加发夹结构，并将改 结论。同时报道称，当crRNA与靶RNA结合出现碱
进的技术成功应用在乙肝病毒 DNA 的分型。本文 基配对错误时，Cas13a 依旧具有 RNA 酶活性，这对
探究了 CRISPR/Cas13a 技术可否对多态性核酸（如 多 态 性 单 核 苷 酸（single nucleotide polymorphism，
TP53 R248W）进行鉴别，从而为肿瘤驱动基因的检 SNP）的 鉴 定 造 成 了 干 扰 ［18］ 。 因 此 ，本 研 究 将
测提供新的帮助。 R248W 突变碱基设计在 crRNA 的间隔序列的 5′末