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第42卷第8期     陈柔柔，李     娜，赫荣波，等. 新诊断2型糖尿病合并高尿酸血症患者的临床特征及肠道菌群变化［J］.
                  2022年8月                  南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（08）：1125-1132，1141                   ·1127 ·


                者仅单用二甲双胍；病史>5年的患者为单用二甲双                           指数、goods_coverage指数和ACE指数进行统计。
                胍或二甲双胍联合基础胰岛素，未用降尿酸、调脂                                β多样性分析：基于 Weighted Unifrac 距离以及
                药物及利尿剂等。                                          Unweighted Unifrac 距离可进行 PCoA（Principal Co-
                    健康对照组：年龄 18~80 岁；血糖正常，无糖尿                     ordinates Analysis）分析 ［10］ ，选择贡献率最大的主坐
                病家族史；正常嘌呤饮食状态下，尿酸正常；近 3 个                         标的组合作图后进行展示。若样本距离越接近，则
                月内未服用微生态制剂或抗生素；近 1 个月内无腹                          表示物种的组成结构越相似。
                泻及其他胃肠道的疾病史，无胃肠道手术史；无长                                OTU差异显著性分析：LDA EffectSize（LEfSe）作
                                                                                                           ［11］
                期服用药物史。                                           为发现和解释高维度的生物标识分析工具之一 ，可
                    排除标准：近 3 个月内服用微生态制剂或抗生                        在组与组间寻找出组间的差异显著物种，本研究用
                素者；有腹泻及其他胃肠道的疾病史；长期酗酒、大                           LDA值柱状分布图及进化分支图来显示。
                量进食动物内脏及海产品等习惯的患者；严重心                             1.3  统计学方法
                脑、肝肾功能障碍；1 型或其他类型糖尿病；长期使                              采用 SPSS23.0 的统计学软件对本实验的数据
                用的药物不符合入组标准。                                      进行统计分析。对正态分布计量资料的数据采用

                1.2  方法                                           均数±标准差（x ± s）描述，两组间比较用独立t 检验
                1.2.1 一般资料及样本收集                                   计算，两组以上用方差分析，对于方差不齐的数据
                    患者临床信息采集主要通过随访问卷、医院信                          采用 Wilcoxon 秩和检验，组间两两比较采用 Tukey⁃
                息系统等多种途径获取患者的基本信息、临床检验                            HSD 检验。通过 Qimme 软件分析 Beta 多样性。分
                结果和临床特征。采集研究对象清晨排便后的新                             组样品的物种组成、群落结构进行差异显著性检验
                鲜粪便标本约 5 g，置于密闭无菌粪便采集盒内，分                         采用的是 T⁃test、LEfSe、MetaStat 等统计学分析方
                别编号。所有粪便采集盒的管壁及管帽上均标注                             法。P＜0.05 为差异有统计学意义。
                患者的姓名、编码等基本信息（油性笔做好标记），
                                                                  2  结 果
                并于 30 min 内迅速储存于-80 ℃低温冰箱中，避免
                反复冻溶。                                             2.1  临床特征比较
                1.2.2 粪便16S rRNA基因测序                                  比较 98 例 T2DM 合并 HUA 患者不同糖尿病病
                    粪便样本基因组DNA的提取采用SDS方法，并                        程（病程<1 年、1~5 年和>5 年）的临床特征，结果显
                进一步使用琼脂糖凝胶电泳法检测 DNA 纯度及浓                          示，不同病程患者的年龄、低密度脂蛋白、并发症发
                度，随后将适量的样品放置在离心管中，用无菌水                            生率差异有统计学意义（P < 0.05）。新诊断 T2DM
                稀释样品至1 ng/μL。选择所需进行测序的区域，采                        合并 HUA 组（病程<1 年）比病程大于 5 年组的低密
                用带 Barcode 特异性引物，16S V3⁃V4 区的引物为                  度脂蛋白显著升高（P < 0.05），年龄及并发症发病率
                341F： CCTAYGGGRBGCASCAG； 806R： GGAC⁃              显著降低（P < 0.05，表1）。
                TACNNGGGTATCT AAT，进一步对细菌的 16S rD⁃                     比较新诊断 T2DM 合并 HUA 与单纯新诊断
                NA V3⁃V4区进行PCR扩增。根据PCR 产物浓度进                      T2DM患者的临床特征，结果显示新诊断T2DM合并
                一步进行等浓度的混样，并充分混合均匀，选取 1×                          HUA 组的糖化血红蛋白水平显著降低（P < 0.05），
                TAE 浓度 2%琼脂糖胶电泳进行纯化 PCR 的产物，                      而总胆固醇、甘油三酯、胰岛素、C 肽水平、血清尿
                主带大小选择在450~550 bp之间的序列，并予割胶                       酸、空腹葡萄糖、动脉硬化指数及脂肪肝发生率显
                回收目标条带。文库的构建采用美国Illumina 公司                       著升高（P < 0.05，表2）。
                的TruSeq DNA PCR⁃Free Library Preparation Kit 建库   2.2  DMUA组与T2DM组、HUA组及Control组的肠
                试剂盒。经过 Qubit 的定量及文库检测后，将构建                        道菌群分析
                好的符合后续测序要求的文库用NovaSeq6000进一                       2.2.1 临床资料比较
                步行上机测序。测序所获得的信息通过优化序列区                                4组研究对象的年龄、性别、体重指数（BMI）、转
                分样本后进行OTU聚类和物种的分类分析。                              氨酶无明显差异（P > 0.05）。DMUA 组与T2DM 组、
                1.2.3 OTU聚类和物种分类分析                                HUA 组及 Control 组相比，高密度脂蛋白降低，甘油
                    α多样性分析：主要用于分析组内微生物群落的                         三酯显著增高（P < 0.05）。DMUA 组与 T2DM 组、
                      ［9］
                多样性 。本研究采用了chao1 指数、PD_whole_tree                 HUA 组相比，其动脉硬化指数亦明显升高（P <
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