Page 80 - 南京医科大学学报自然科学版

第42卷第8期
·1122 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2022年8月

A B C
post⁃mutation pre⁃mutation fusion
site amplicon site amplicon M segment M Wild type
2 000 bp 2 000 bp
1 000 bp TP53
750 bp 1 000 bp
500 bp 750 bp
500 bp
250 bp R248W
250 bp
100 bp 100 bp
TP53
A：TP53基因前、后段电泳结果；B：前、后段融合而成的TP53 R248W变异体电泳结果；C：野生型与变异体的测序结果比对。
图1 TP53 R248W突变株构建电泳结果与测序结果
Figure 1 The result of electrophoresis and sequencing of TP53 R248W mutant strain

A Primer1 Primer2
Wild type （ RAA）
Wild type （ PCR ） R248W （ RAA） Wild type （ PCR ） Wild type （ RAA）
R248W （ RAA）
R248W （ PCR ）
R248W （ PCR ）
M M
2 000 bp 2 000 bp
1 000 bp 1 000 bp
750 bp 750 bp
500 bp 500 bp
250 bp 368 bp— 250 bp
110 bp—
100 bp 100 bp

B C
2 000 2 000 Wild type（PCR⁃Primer1）
*** R248W（PCR⁃Primer1）
***
1 500 1 500 Wild type（RAA⁃Primer1）
RFU 1 000 RFU 1 000 R248W（RAA⁃Primer1）
Wild type（PCR⁃Primer2）
R248W（PCR⁃Primer12）
500 500
Wild type（RAA⁃Primer2）
R248W（RAA⁃Primer2）
0 0 0 20 40 60 80
Wild type （ RAA⁃Primer1 ）
R248W （ RAA⁃Primer1 ）
Wild type （ RAA⁃Primer2 ）
R248W （ RAA⁃Primer2 ）
R248W （ PCR⁃Primer1 ）
Wild type （ PCR⁃Primer1 ） R248W （ PCR⁃Primer2 ） 时间（min）
Wild type （ PCR⁃Primer2 ）
A：Primer1和Primer2扩增产物（RAA 和PCR）琼脂糖凝胶电泳图；B：Primer1和Primer2扩增产物的 CRISPR/Cas13a 检测结果；C：CRISPR/
Cas13a检测结果曲线。两组比较， P < 0.001。
***
图2 Primer1和Primer2扩增产物的电泳结果及CRISPR/Cas13a检测结果
Figure 2 The result of electrophoresis and CRISPR/Cas13a for Primer1 and Primer2 amplification product

TP53 R248W 的检测效果，通过按比例混合 TP53 野 的检测效果，以模拟血浆 ctDNA 为模板，扩增含突
生型和R248W变异体质粒，获得了不同突变频率的 变位点的序列片段（图 5A）。使用 CRISPR/Cas13a
变异体。以混合质粒为模板，扩增含突变位点的序 技术检测扩增产物，结果显示，当血浆中的 TP53
列片段（图 4A）。使用 CRISPR/Cas13a 技术检测扩 R248W 变异体浓度达到 1×10 copies/μL，其 RFU 值
4
增产物，结果显示，不同突变频率的变异体检测结 明显高于野生型血浆，差异具有统计学意义（P <
果 RFU 值显著高于野生型，差异具有统计学意义 0.01），表明本研究方法最低能检测出模拟血浆中浓
（P < 0.05），其中，本研究方法最低可以检测出突变 度为1×10 copies/μL的TP53 R248W变异体（图5B）。
4
频率为 0.01%的混合质粒（含有 1×10 copies 的变异
3
3 讨 论
体），表明 TP53 基因野生型的存在基本不影响
TR248W变异体的检出（图4B）。 Cas13a 蛋白在体外具有 RNA 酶活性，因此，研

2.5 CRISPR/Cas13a对模拟血浆ctDNA的检测 究者探索了其在病原微生物核酸检测及基因分型
为探究 CRISPR/Cas13a 技术对模拟血浆 ctDNA 中具有潜在的应用价值 ［10-12］ 。Gootenberg 等 ［13］ 通过