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第42卷第8期      邝振展，肖     斌，孙朝晖，等. 基于CRISPR/Cas13a技术检测肿瘤驱动基因TP53 R248W的研究［J］.
                  2022年8月                    南京医科大学学报（自然科学版），2022，42（08）：1119-1124                      ·1121 ·


                连接产物转化入Top10细胞，取菌液进行测序鉴定。                         血浆DNA提取试剂盒，按说明书操作提取模拟血浆
                1.2.2 PCR或RAA扩增TP53 R248W变异体                      ctDNA，取 2 μL 模拟血浆 ctDNA 进行 PCR 扩增，随
                    本研究使用两对扩增引物 Primer1（R248W⁃                    后使用上述优化的CRIPSR/Cas13a方法进行检测。
                RAA⁃F&R248W⁃RAA⁃R1）和 Primer2（R248W⁃RAA⁃           1.3  统计学方法
                F&R248W⁃RAA⁃R2），利用 PCR 或重组酶介导链置                       采用 SPSS 19.0 软件进行统计学分析。计量资
                换核酸扩增技术（recombinase aided amplification，          料经K⁃S正态性检验，若呈正态分布，采用方差分析
                RAA）扩 增 技 术 ，按 说 明 书 指 导 扩 增 出 含 TP53             或者t检验，若呈偏态分布，采用非参数Mann⁃Whit⁃
                R248W 突变序列片段。PCR 的扩增体系如下：                         ney U 检验。计数资料用卡方检验，P < 0.05为差异
                TP53 R248W 质粒（1 μmol/L）1 μL，前、后引物混合               有统计学意义。
                物（10 μmol/L）2 μL，高保真聚合酶混合物 25 μL，纯
                                                                  2  结 果
                水22 μL。将上述试剂充分混匀后，进行PCR扩增，
                PCR 的扩增程序如下：98 ℃ 预热 5 min，然后 98 ℃                 2.1  TP53 R248W变异体质粒的构建
                10 s，58 ℃ 15 s，72 ℃ 30 s，循环 40 次，最后 72 ℃ 孵            根据 PCR 点突变技术，利用两对携带 TP53
                育10 min。RAA的扩增体系如下：TP53 R248W质粒                   R248W（C>T）点突变的引物，将TP53野生型序列扩
               （1 μmol/L）1 μL，前、后引物混合物 2 μL，RAA反应液                增成前后2个片段，这两片段均含有突变位点序列，
                29.5 μL，MgCl2 2.5 μL，纯水15 μL。将上述试剂充分              以及前段的3′端及后段5′端存在互补序列（图1A），
                混匀后，加入RAA干粉管中，然后39 ℃孵育20 min。                     然后使用Over⁃lap PCR 将2个基因片段融合成完整
                1.2.3  CRIPSR/Cas13a 方法对 TP53 R248W 变异体           的 TP53 R248W 变异体（图 1B），经与 pENTER 质粒
                检测                                                连接后转化入 Top10 感受态，测序结果显示 TP53
                    对步骤 1.2.2 的扩增产物进行检测，体系如下：                     R248W变异体质粒构建成功。
                扩增产物 2 μL，crRNA（1 μmol/L）1 μL，Cas13a蛋白            2.2  CRISPR/Cas13a 联 合 PCR 或 RAA 技 术 检 测
               （10 μmol/L）1 μL，荧光探针（10 μmol/L）1 μL，T7转录           TP53 R248W突变株
                酶1 μL，RNA酶抑制剂 1 μL，T7 buffer（5×）4 μL，NTP              根据TP53 R248W变异体序列设计两对扩增引
                2 μL，无RNA酶纯水补足反应体系至20 μL，混匀后置                     物（Primer 1和Primer 2）。对于Primer 1和Primer 2，
                于Bio⁃Rad CFX 荧光检测仪，37 ℃检测1 h，记录各时                 PCR 和 RAA 技术均成功扩增出约 110 bp 和 368 bp
                间段的相对荧光值（relative fluorescence unit，RFU）。         的片段（图 2A）。使用 CRISPR/Cas13a 方法检测扩
                1.2.4 CRIPSR/Cas13a检测体系中crRNA浓度的优化                增产物，结果表明，在10 min内，各组RFU值均达到
                    将 crRNA 梯度稀释成 5 个浓度，使检测反应体                    平台期，但基于 Primer 1 扩增的片段，TP53 R248W
                系中的 crRNA 终浓度分别为 0.05、0.10、0.15、0.20、             变异体的 RFU 值与野生型相比无显著性差异（P >
                0.25 μmol/L。除 crRNA 外，CRIPSR/Cas13a 检测反           0.05）；而基于 Primer 2 扩增的片段，变异体的 RFU
                应体系如步骤1.2.3。                                      值显著高于野生型（P < 0.001，图2B、C）。
                1.2.5  CRIPSR/Cas13a 方 法 对 不 同 突 变 率 TP53         2.3  不同浓度crRNA对TP53 R248W变异体检测结
                R248W的检测                                          果的影响
                    将浓度为 1×10 、1×10 、1×10 、1×10 拷贝数                   为了探究不同浓度的crRNA对TP53 R248W变
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                                                     7            异体检测结果的影响，对crRNA 进行了梯度浓度稀
               （copies）/μL的TP53 R248W质粒分别与1×10 copies/μL
                的 TP53 野生株混合 1∶1 混合，形成突变频率为                       释，并分别进行CRISPR/Cas13a检测。结果表明，在
                0.01%、0.1%、1%、10%，取2 μL混合物进行PCR扩增，                0.05~0.25 μmol/L 范围内，随着 crRNA 浓度的增加，
                然后用上述优化的CRIPSR/Cas13a方法进行检测。                      RFU值也随之增大，其中crRNA浓度达到0.20 μmol/L
                1.2.6 CRIPSR/Cas13a方法对模拟血浆ctDNA的检测                及以上时，差异具有统计学意义（P < 0.001），表明
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                    将浓度为 1×10 、1×10 、1×10 、1×10 、1×10 、1×         crRNA 浓度的上升会提高 TP53 R248W 变异体的检
                10 copies/μL 的 TP53 R248W 质粒取 1 μL 分别与            测强度（图3）。
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                1 mL 经基因检测无 TP53 突变的人血浆混合，构建                      2.4  CRISPR/Cas13a 检 测 不 同 突 变 频 率 的 TP53
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                TP53 R248W 突变基因浓度分别为 1×10 、1×10 、1×               R248W
                10 、1×10 、1×10 、1×10 copies/μL的模拟血浆。使用                为探究CRISPR/Cas13a方法对不同突变频率的
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