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第43卷第1期 田 祯，庄皓冉，江楚雯，等. YAP通过调控EEF1A2的表达促进肝癌细胞的迁移和侵袭［J］.
2023年1月 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（01）：008-016 · 9 ·

［Key words］ eukaryotic translation elongation factor 1 alpha 2；yes⁃associated protein；cell migration and invasion；hepatocellular
carcinoma cell
［J Nanjing Med Univ，2023，43（01）：008⁃016］

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是最 载体（ViGene Biosciences 公司，美国）；pMD2.G 和
常见的原发性肝癌，全球每年 HCC 患者死亡人数 psPAX2（Addgene 公司，美国）；TRIzol（Invitrogen 公
［1］
超过 80 万 。HCC 的发生和发展是一个多步骤的 司，美国）；Lenti⁃Pac慢病毒包装试剂盒（GeneCopoeia
过程，涉及众多基因和相关信号通路。研究表明， 公司，美国）；Transwell细胞培养小室（Corning公司，
Hippo 信号通路中的上游因子通过一系列激酶级 美 国）；HiScript Q RT SuperMix for qPCR 和 AceQ
联反应转录激活下游终末效应分子 Yes 相关蛋白 qPCR SYBR Green Master Mix（南京诺唯赞生物公
（yes⁃associated protein，YAP）和具有 PDZ 结合基序 司）；兔抗人 EEF1A2 多克隆抗体（上海爱必信生物

的转录共活化因子（transcriptional co⁃activator with 公司）；小鼠抗人 E⁃Cadherin 单克隆抗体（BD 公司，
PDZ⁃binding motif，TAZ），进而调控下游影响细胞增 美国）；兔抗人 YAP/TAZ、YAP、Snail 单克隆抗体以
殖、上皮间质转化（epithelial⁃mesenchymal transition， 及HRP标记的抗兔IgG和抗小鼠IgG以及染色质靶
EMT）以及肿瘤转移等相关基因的表达，从而在肝 向酶切检测（cleavage under targets and release using
癌的发生和发展进程中发挥关键作用 。真核细 nuclease，CUT&RUN）试剂盒（CST公司，美国）；小鼠
［2］
胞翻译延伸因子 1α（EEF1A）的两个亚型 EEF1A1 抗 GAPDH 单克隆抗体（上海康成生物公司）；表达
和 EEF1A2，通过促进氨酰基 tRNA 与核糖体 A 位 YAP 的腺病毒、表达 EEF1A2 的腺病毒以及对照腺
点的结合，在蛋白质合成过程中对新生多肽的延 病毒（山东维真生物科技有限公司）；靶向 YAP、
伸发挥重要作用 。EEF1A1 为广泛表达的蛋白， EEF1A2 的寡核苷酸引物、对照引物以及定量 PCR
［3］
而 EEF1A2 的表达具有组织特异性。研究发现， 引物均由北京擎科生物科技有限公司合成。
EEF1A2 在多种肿瘤（包括卵巢癌、乳腺癌、肺癌 1.2 方法
等）中高表达，并与肿瘤的发生和发展密切相关 ［3-4］ ； 1.2.1 细胞培养
EEF1A2 在肝癌组织中高表达，并可通过 EEF1A2/ 所有细胞常规培养于含10%胎牛血清、1%青霉
PI3K/AKT 信号轴调控肝癌的发生和发展 ［5-6］ ，但是 素/链霉素的 DMEM 高塘培养基中，于 37℃、5% CO2
有关 EEF1A2 在肝癌发生和发展过程中的作用方 培养箱中培养。
式及其机制仍然有待进一步研究。研究发现 YAP 1.2.2 慢病毒载体的构建、包装和稳定株的筛选
在肝癌组织中高表达，并与肝癌的发生和发展密切 合成靶向YAP（正义链序列5′⁃GATCCGCTGGTC⁃
相关 ［7- 9］ ，然而，目前尚不清楚 YAP 能否通过调控 AGAGATACTTCTTAATTCAAGAGATTAGAAGTAT ⁃
EEF1A2的表达影响肝癌的发生和发展。 CTCTGACCAGCTTTTTTA⁃3′；反义链序列5′⁃CGCG⁃
本研究通过 YAP 和 EEF1A2 干扰表达和过表 TAAAAAAGCTGGTCAGAGATACTTCTTAATCTCTT⁃
达，建立不同迁移能力的肝癌细胞模型，阐明 YAP GAATTAAGAAGTATCTCTGACCGCG⁃3′）和EEF1A2
通过调控EEF1A2促进肝癌细胞迁移和侵袭的作用 （正 义 链 序 列 5′ ⁃ GATCCTTCACCTCCCAGGTCAT⁃
机制。 CATCCTCGAGGATGATGACCTGGGAGGTGAATTT ⁃

TTA⁃3′；反义链序列 5′⁃ CGCGTAAAAATTCACC⁃
1 材料和方法
TCCCAGGTCATCATCCTCGAGGATGATGACCTGG ⁃
1.1 材料 GAGGTGAAG⁃3′）的寡核苷酸引物以及对照引物
人 肝 癌 细 胞 株 HepG2、SMMC7721、Hep3B、 （正义链序列 5′⁃GATCCTGGTTTACATGTCGACTA⁃
HCCLM3、SK⁃HEP1 和 HEK293T 细胞由本实验室保 ATTCAAGAGATTAGTCGACATGTAAACCATTTTTT ⁃
存；DMEM 培养基和胎牛血清（Gibco 公司，美国）； A⁃3′；反义链序列：5′⁃CGCGTAAAAAATGGTTTA⁃
100 × 青霉素/链霉素双抗、RIPA 裂解液、BCA 蛋白 CATGTCGACTAATCTCTTGAATTAGTCGACATGTA⁃
定量检测试剂盒、蛋白上样缓冲液、超敏 ECL 化学 AACCACG⁃3′）；分别克隆到 pLent⁃U6⁃Puro 载体的

发光试剂盒（苏州新赛美生物公司）；pLent⁃U6⁃Puro BamHⅠ和MluⅠ位点间，经测序成功后，与pMD2.G