Page 16 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第1期
               · 10  ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年1月


              和 psPAX2 共转染 HEK293T 细胞进行慢病毒的包                    1.2.6  CUT&RUN⁃qPCR实验
              装，转染 60 h 后收集细胞上清并用 0.45 μm 的滤                         CUT&RUN 试剂盒为美国 CST 公司产品，按照
              器 过 滤 ；使 用 慢 病 毒 液 分 别 感 染 SMMC7721 和             试 剂 盒 操 作 说 明 书 操 作 。 简 要 过 程 如 下 ：
              SK⁃HEP1肝癌细胞后，采用嘌呤霉素筛选14 d获得                       SMMC7721 细胞与磁珠孵育后，加入兔抗人 YAP
              稳定细胞株。                                            单克隆抗体与细胞中 YAP 结合，与二抗孵育后加
              1.2.3 实时定量PCR（real⁃time quantitative PCR，RT⁃      入 Protein A/G⁃Tn5 转座体与抗体结合后，再加入
              qPCR）检测相关基因的mRNA表达水平                              Mg 激活转座体，使得 DNA 片段化，提取 DNA 进行
                                                                   2+
                  TRIzol 试剂盒提取对数生长期的各组细胞的                       qPCR 验证，qPCR 上游引物序列为 5′⁃CATGGTGC⁃

              总 RNA 后，采用 HiScript Q RT SuperMix for qPCR        GCCCAGGAG ⁃ 3′ ，下 游 引 物 序 列 为 5′ ⁃ GGCCT⁃
              试剂盒和 AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 试剂           CAGGGTGGAAATCTG⁃3′。分别计算 YAP 抗体和

              盒分别进行逆转录和qPCR。qPCR反应条件：95 ℃                       IgG 富集后扩增的 DNA 占输入染色质的比值，实验
              5 min 预变性；95 ℃ 10 s，60 ℃ 34 s，40 个循环。             结果用 YAP 抗体富集的 DNA 与 IgG 富集的 DNA 的

              EEF1A2 的上游引物序列为 5′⁃GGACCATTGAGAA                  倍数表示。
              GTTCGAGA⁃3′，下游引物序列为 5′⁃AGCACCCAG⁃                 1.3  统计学方法
              GCATACTTGAA⁃ 3′；Snail 的上游引物序列为 5′⁃                     应用软件SPSS19.0和Excel 2013对数据进行分
              AATCGGAAGCCTAACTACAGCG⁃3′，下游引物序列                  析，数据采用均值±标准差（x ± s）表示，两组间比较

              为 5′⁃GT CCCAGATGAGCATTGGCA⁃3′；E⁃cadherin          采用t检验，P < 0.05为差异有统计学意义。
              的上游引物序列为5′⁃CAAGTGACC ACCTTAGAG⁃3′，
              下游引物序列为 5′⁃GAATTTGCAATCCTGCTT⁃3′；                 2 结     果
              GAPDH 上游引物序列为 5′⁃GCACCGTCAAGGCT⁃                  2.1  YAP和EEF1A2对不同迁移能力的肝癌细胞迁
              GAGAAC⁃3′，下游引物序列为5′⁃TGGTGAAGACGC⁃                 移和侵袭的影响
              CAGTGGA⁃3′。使用 LightCycler 96 软件进行数据                    通过查阅癌症基因组图谱（the cancer genome
                                           ®
              分析，以GAPDH为内参，按照2            -ΔΔCt 方法计算出目的         atlas，TCGA）数据库（http：//gepia.cancerpku.cn/index.
              基因的相对表达量。                                         html）分析 EEF1A2 在肝癌组织以及癌旁组织中的
              1.2.4  Western blot检测相关基因的蛋白表达水平                  表达，结果显示 EEF1A2 在肝癌组织中的 mRNA 水
                  采用 RIPA 裂解液提取各组细胞中的总蛋白，                       平显著高于癌旁组织（P < 0.01，图 1A）。Western
              BCA 蛋白定量试剂盒进行蛋白定量、变性后进行                           blot 法检测不同迁移能力的肝癌细胞系（低迁移能
              SDS⁃PAGE，样品转膜至PVDF膜上，采用5%的脱脂                      力的 HepG2、SMMC7721 和 Hep3B 细胞系以及高迁
              奶粉封闭后与相应的一抗于 4 ℃孵育过夜；加入相                          移能力的HCCLM3和SK⁃HEP1细胞系）中YAP/TAZ
              应二抗室温孵育后，滴加 ECL 发光液，于全自动化                         和 EEF1A2 的表达，结果显示 YAP/TAZ 和 EEF1A2
              学发光仪成像。                                           在高迁移能力的肝癌细胞 HCCLM3 和 SK⁃HEP1 中
              1.2.5  细胞迁移与侵袭实验                                  的 表 达 均 高 于 低 迁 移 能 力 的 肝 癌 细 胞 HepG2、
                  实验按文献      ［10］ 的方法进行，简要过程如下：选                SMMC7721 和 Hep3B（图 1B），该 结 果 表 明 YAP/
              择血清饥饿过夜后的各组细胞，制备细胞悬液；                             TAZ 和 EEF1A2 的表达可能与肝癌细胞的迁移能
              细胞计数后，用不含胎牛血清的 DMEM 培养基将                          力相关。

                                            5                        为了研究YAP和EEF1A2对肝癌细胞迁移和侵
              SMMC⁃7721 细胞调整为 1.5×10 个/mL，SK⁃HEP1
              细胞调整为 1.0×10 个/mL；分别取 200 μL 的上述                  袭 的 影 响 ，本 研 究 制 备 干 扰 YAP 表 达 和 干 扰
                                5
              细胞悬液接种到预先铺有 Matrigel 或未铺 Matrigel                 EEF1A2 表达的重组慢病毒以及对照慢病毒，分别
              的 Transwell 小室中，然后将 Transwell 小室放入含               感染低迁移能力的 SMMC⁃7721 细胞和高迁移能力
              600 μL完全培养基的Transwell下室中，于37 ℃继续                  的SK⁃HEP1细胞，采用嘌呤霉素筛选2周后，建立了
              培养 24 h。取出 Transwell 小室置于 4%多聚甲醛固                 稳定干扰表达细胞模型；其次，通过在SMMC7721和
              定液中室温固定后，用棉签拭去小室内侧的细胞，                            SK⁃HEP1 细胞中分别感染表达 YAP、EEF1A2 的腺
              采用结晶紫染液染色迁移和侵袭的细胞，于倒置相                            病毒，构建了 YAP 和 EEF1A2 过表达的肝癌细胞模
              差显微镜下观察并统计迁移和侵袭的细胞数。                              型；采用 Western blot 方法进行基因表达鉴定，结果
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