Page 17 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第11期 颜 凤，邱佳韵，庄丽丽，等. 转录因子STAT1对癌症相关基因Gas6的调控研究［J］.
2023年11月 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（11）：1487-1493 ·1489 ·

1450 作为模板构建 STAT1 结合位点突变的启动子 1.2.5 双萤光素酶报告基因实验
4
重组质粒，将其命名为 pGas6⁃1450 mut1、pGas6⁃ 在96孔板中培养HEK⁃293T细胞（1×10 个/孔），
1450 mut2、pGas6⁃1450 mut1+2（合称为 pGas6⁃1450 24 h 后将待测质粒（100 ng）pGas6⁃1450 或 pGas6⁃
mut）并测序鉴定，突变序列见图1。 1450 mut与pRL⁃TK质粒（4 ng）共同转染至细胞中，

原始序列⁃821 5′⁃GCAAAGAGAAACTG. . . . . .ATAAAAGGAAACCG⁃3′ ⁃414
突变序列⁃821 5′⁃GCAAAGAGGAACTG. . . . . .ATAAAAGGGAACCG⁃3′ ⁃414
mut1 mut2
图1 突变序列
Figure 1 The mutated sequences

再培养24 h后检测启动子活性；将待测质粒和siRNA 表3 qRT⁃PCR引物序列
50 nmol/L或过表达质粒（100 ng）与 pRL⁃TK 质粒共 Table 3 Sequences of qRT⁃PCR primers
同转染至细胞，检测敲低或过表达STAT1对启动子 名称 序列（5′→3′）
活性的影响；使用荧光光度计和双萤光素酶检测试 STAT1 上游：AGTCCAGCTTCTGCTTACCC
下游：CTGAACGTGGCGAGAGTCAT
剂盒检测启动子活性，启动子活性统一标准化为
Gas6 上游：TGGCATGTGGCAGACAATCT
pRL⁃TK的活性。结果重复3次及以上，siRNA序列见
下游：ATACCTCCCACGGTCAGGTT
表2。
GAPDH 上游：GAGTCAACGGATTTGGTCGT
表2 siRNA序列 下游：TTGATTTTGGAGGGATCTCG
Table 2 Sequences of siRNA

siRNA 序列（5′→3′） 摇床孵育一抗10~12 h，TBST洗膜3次（20 min/次），室
siSTAT1 正义链：CCUCCAUCCUUUGGUACAATT 温摇床孵育二抗1 h，再洗膜后曝光显影。完成第一
反义链：UUGUACCAAAGGAUGGAGGTT 次化学发光检测后分别用蒸馏水、一抗二抗去除
siNC 正义链：UUCUCCGAACGUGUCACGUTT 液、蒸馏水各漂洗 5 min 后进行封闭等后续操作以
反义链：ACGUGACACGUUCGGAGAATT
完成第二次化学发光检测。该实验以GAPDH 作为
1.2.6 实时荧光定量PCR（qRT⁃PCR） 内参并重复3次以上。
在12孔板中培养HEK⁃293T细胞（1×10 个/孔）。 1.3 统计学方法
5
24 h 后将 siRNA、过表达质粒和其对照试剂转染至 应用 GraphPad Prism6 与 SPSS 25.0 软件对实验
细胞中，再培养24 h后检测敲低和过表达STAT1对 数据进行统计分析。实验结果以均数±标准差（x ± s）
Gas6 mRNA 表达的影响。使用 Omega RNA 提取试 表示，两组间比较采用t检验。P＜0.05为差异有统
剂盒提取细胞总 RNA，再将其均逆转录为第 1 链 计学意义。
cDNA，并 进 行 qRT⁃PCR 实 验（反 应 条 件 ：95 ℃
2 结 果
10 min ；95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s ，循 环
40 次；95 ℃ 15 s，60 ℃ 1 min，95 ℃ 15 s）。该实验 2.1 生信分析
以 GAPDH 作为内参进行 3 次以上，并以 2 -ΔΔCt 评估 应用GEO数据库分析得出乳腺癌的高表达（红
mRNA相对表达水平，相关引物序列见表3。 色）及低表达（绿色）基因（图2A），其中Gas6属于高
1.2.7 Western blot实验 表达基因（图 2B）；应用 PROMO 数据库和 JASPAR
在6孔板中培养HEK⁃293T 细胞（2×10 个/孔）， 数据库预测出转录因子 STAT1 与 Gas6 启动子有多
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24 h 后将 siRNA、过表达质粒和其对照试剂转染至 个结合位点，以此设计了两个突变位点使Gas6不能
细胞中，再培养48 h 后使用总蛋白提取试剂盒提取 与相应转录因子结合；应 用 GEPIA 数据库分析
细胞总蛋白，加入适量上样缓冲液后 100 ℃煮沸 STAT1 和 Gas6 在多种癌症中的相关性，结果表明
10 min。制备 10% SDS⁃PAGE 凝胶，加样、电泳（电 STAT1 与 Gas6 在多种癌症中有正相关趋势（P 均＜
泳条件：80 V，30 min；150 V，40 min）并在快速转膜液 0.05，图2C~E）。
中（转膜条件：常温恒流400 mA，30 min）将蛋白转至 2.2 转录因子STAT1与Gas6启动子结合

PVDF膜，用快速封闭液室温摇床封闭30 min后4 ℃ 为探究 STAT1 是否与 Gas6 启动子结合，使用