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第43卷第11期
               ·1488 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年11月


                                          ［7］
              期，不良反应较大，复发率较高 。因此，有必要探                           1.2  方法
              究影响癌症进展的潜在分子机制，并以此提供新的                            1.2.1 生信分析
              诊疗方法。                                                  用 GEO 数 据 库（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/
                  生长抑制特异性基因6（growth arrest specific 6，          gds 和 https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geoprofiles）预测
              Gas6）编码一种可与受体酪氨酸激酶Axl、Mer和Tyro3                   乳腺癌的高表达及低表达基因聚类分析结果；用
              结合的维生素 K 依赖性分泌型蛋白。细胞因子                            PROMO 数 据 库（http：//alggen.lsi.upc.es/cgi ⁃ bin/pro⁃
              Gas6 通过与 TAM（Tyro3⁃Axl⁃Mer）受体结合激活下                mo_v3/promo/promoinit.cgi?dirDB=TF_8.3）和JASPAR
              游信号通路（如PI3K、PLCγ、ERK和NF⁃κB）以调节细                   数据库（https：//jaspar.genereg.net）预测 Gas6 启动子
                                               ［8］
              胞存活、增殖、分化、迁移、黏附和凋亡 。研究表明，                         的转录因子结合位点；用 GEPIA 数据库（http：//ge⁃
              Gas6通过诱导肿瘤相关巨噬细胞转化为免疫抑制的                          pia.cancer⁃pku.cn）预测Gas6和STAT1在多种癌症中
              M2 样表型促进癌症进展          ［9-10］ ，这些肿瘤包括乳腺癌、          的相关性。
                  ［11］
              肺癌 、骨肉瘤、肝癌和肾细胞癌等，并且Gas6/Axl的                      1.2.2 细胞培养
              表达水平与乳腺癌的不良临床结局相关 。                                    在37 ℃、5% CO2培养箱中将HEK⁃293T 细胞置
                                                ［9］
                  据此，本研究通过染色质免疫沉淀（chromatin                     于含 1%青链霉素双抗和 10%胎牛血清的 DMEM 高
              immunoprecipitation，ChIP）实验检测信号转导和转               糖培养基中培养，2~3 d换液1次，细胞密度为85%~

              录激活因子 1（signal transducer and activator of tran⁃  100%时传代或冻存，均使用对数期生长细胞。
              scription 1，STAT1）是否与Gas6启动子结合，将含人                1.2.3 ChIP实验
              Gas6 启动子或 STAT1 结合位点突变的 Gas6 启动子                       使用 ChIP 试剂盒，依据其说明书进行相关实
              的萤光素酶报告质粒转染至 HEK⁃293T 细胞，同时                       验及分析。在 1%甲醛中固定 HEK⁃293T 细胞约
              敲低或过表达转录因子 STAT1，应用双萤光素酶报                         10 min，充分裂解细胞，超声剪切基因组 DNA 为
              告基因系统检测Gas6启动子的活性变化。在HEK⁃                         200~800 bp大小（去除交联并进行琼脂糖凝胶电泳观
              293T细胞中敲低或过表达转录因子STAT1，应用实                        察DNA大小）。将合格样品分别进行特异性免疫沉
              时荧光定量 PCR 和蛋白质免疫印迹技术分别检测                          淀并去除交联，选择相应引物进行 qRT⁃PCR 或
              Gas6 mRNA 和蛋白表达。本研究探讨了转录因子                        PCR，进行琼脂糖凝胶电泳实验并观察结果，相关引
              STAT1对癌症相关基因Gas6的调控，为阐明Gas6在                      物见表1。
              癌症中的作用和机制奠定了基础。                                                   表1  PCR引物序列

              1  材料和方法                                                   Table 1 Sequences of PCR primers
                                                                   名称                   序列（5′→3′）
              1.1  材料                                             Gas6⁃1     上游：CCCACTTTCAAACCAGTGACCT
                  人胚肾细胞（HEK⁃293T）、pRL⁃TK（海肾萤光素                               下游：CTCAGCAGGCTCAACGCTTA
              酶报告质粒）为本实验室保存；DMEM培养基（Gibco                         Gas6⁃2     上游：TGGTCTCTGAAGACAAGCACA
              公司，美国）；含 Gas6 启动子及点突变的 Gas6 启                                  下游：CGAGTGAAATGCGACGGTTT
              动子的萤光素酶报告质粒、STAT1 过表达质粒                             GAPDH      上游：TACTAGCGGTTTTACGGGCG
                                                                             下游：TCGAACAGGAGGAGCAGAGAGCGA
              pENTER⁃STAT1 及 pENTER、引物、STAT1 的小干扰
              RNA（small interfering RNA，siRNA）siSTAT1 及 siNC    1.2.4 萤光素酶报告基因重组质粒的构建与鉴定
             （南京擎科生物科技有限公司）；SDS⁃PAGE 凝胶配                             应用美国国立生物技术信息中心数据库 NCBI
              制试剂盒、Western blot 一抗二抗去除液（强碱性）、                   （https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gene）查 询 人 Gas6 基
              ChIP检测试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司）；                         因（GenBank 编号：NC_000013.11）转录起始位点
              RNA 提取试剂盒、去内毒素小量质粒提取试剂盒                           （transcription start site，TSS）上游1 400 bp、下游50 bp
             （Omega公司，美国）；双萤光素酶报告基因检测试剂                         的片段序列。将人 Gas6 基因的转录起始位点碱
              盒（Promega 公司，美国）；Gas6、GAPDH、STAT1 一               基 编 号 为 + 1。 将 人 Gas6 启 动 子 片 段（- 1 400~
              抗及羊抗兔二抗（武汉三鹰生物技术有限公司）；总                           +50 bp）插入 pGL3⁃Basic 载体以构建质粒 pGas6⁃
              蛋白提取试剂盒（南京凯基生物技术股份有限公司）；                          1450 并测序，应用 NCBI 的 blast（https：//blast.ncbi.
              全DNA提取试剂盒（北京天根生化科技有限公司）。                          nlm.nih.gov/Blast.cgi）工具鉴定该质粒。并以pGas6⁃
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