Page 24 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第11期
               ·1496 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年11月


              达与肿瘤分期、淋巴结状态等临床病理数据的关                             后 1、2、3 d 加入 CCK⁃8 试剂孵育 1 h，用酶标仪测定
              系，并进一步利用 R 软件 survival 程序包分析 miR⁃                 450 nm处吸光度。
              449c 对 DFS 和疾病特异性生存期（disease specific             1.2.7 流式细胞术分析细胞周期
                                ［20］
              survival，DSS）的影响 。                                     细胞转染 3 d 后，收集细胞，1 000 r/min 离心
              1.2.3 体细胞突变分析及富集分析                                5 min，PBS 清洗细胞 2 次，在-20 ℃下置于 70%乙醇
                  通过 Maftools R/Bioconductor 软件从 MAF 文件         中固定。固定后，PBS 洗涤2次，加入含有RNase A的
              中提取 miR⁃449c 低表达患者详细的突变信息并进                       50 mg/mL PI 染色溶液，室温下避光孵育 30 min。
              行分析   ［21］ 。利用 GSEA 软件和 edgeR 包进行单基因              FACScan流式细胞仪分析细胞周期。
              富集分析，筛选显著富集的信号通路，P < 0.05为筛选                      1.2.8 流式细胞术检测细胞凋亡
              标准。利用 TargetScan（http：//www.targetscan.org）、           细胞转染 3 d 后，收集细胞，1 000 r/min 离心

              miRanda （http：//www.microrna.org） 和 mirTarBase    5 min；PBS洗涤2次，Binding Buffer重悬细胞，分别加
             （http：//mirtarbase.mbc.nctu.edu.tw）网站预测miR⁃449c    入 FITC⁃Annexin V 和 PI 各 5 μL，避光孵育 20 min。
              的靶基因。进行KEGG和GO通路分析和功能注释，                          用 Binding Buffer 补足体积至 500 μL，FACScan 流式
              评估识别候选靶基因中重要的信号转导通路和富                             细胞仪检测细胞凋亡率。
              集通路，P < 0.05为筛选标准。                                1.2.9 Western blot分析
              1.2.4 细胞培养及转染                                          转染3 d后细胞用预冷PBS清洗2次，加入预冷
                  将细胞置于 37 ℃ 、5% CO2的培养箱中用含有                    RIPA缓冲液裂解，收集裂解液，于4 ℃、14 000 g离心
              10%胎牛血清的RPMI 1640培养基培养，每隔3~4 d                    15 min，取上清液用 BCA 蛋白质测定试剂盒测定蛋
              传代。取对数生长期细胞接种于 6 孔板，24 h 后根                       白质浓度。蛋白变性后在 NuPAGE 10% Bis⁃Tris 凝
              据 Lipofectamine 3000 说明书的步骤，将 miR⁃449c⁃           胶上电泳，电泳完毕后用300 mA湿转2 h，待蛋白转
              mimic及miR⁃NC和/或pENTER⁃c⁃Myc及pENTER转               移到 PVDF 膜上后，用 5%脱脂奶粉溶液封闭 1 h。
              染肺腺癌细胞。                                           加入一抗在4 ℃下孵育过夜，TBST清洗后常温孵育
              1.2.5 RT⁃PCR实验                                    二抗1 h。TBST清洗后ECL化学发光法显影后经化
                  根据说明书，使用 TRIzol 试剂从细胞中提取总                     学发光成像系统曝光检测目的条带。
              RNA，使用 Prime⁃Script RT 试剂进行逆转录反应。                 1.3  统计学方法
              实时荧光定量 PCR 使用 SYBR Select Master Mix 在                 使用 GraphPad Prism 第 8 版进行统计分析。计
              7300 Real⁃Time PCR 系统上进行。引物序列见表                   量资料采用均数±标准差（x ± s）表示。Student’s t⁃
              1。以 2  - ΔCt  计算组织标本和细胞中 miR⁃449c 相对              检验或 Wilcoxon 秩和检验评估组间差异。所有实
                         -ΔΔCt  计算转染后细胞中基因相对表达                  验均重复3次，P < 0.05为差异有统计学意义。
              表达量，以 2
              水平。
                                                                2  结 果
                         表1 用于RT⁃PCR的引物序列
                       Table 1 Primers used for RT⁃PCR          2.1  肺腺癌患者 miR⁃449c 表达与临床病理学特征
               基因名称                     引物（5′→3′）               和预后的关系
                                                                     共有25个显著差异表达的miRNA，其中肺腺癌
               c⁃Myc           F：GCCAGCCCTGAGCCCCTAGT
                               R：GGGCTGTGCGGAGGTTTGCT           高复发风险组中有 18 个 miRNA 下调（包括 miR⁃
               MET             F：AGCAATGGGGAGTGTAAAGAGG         449c），7 个 miRNA 上调（图 1A）。miR⁃449c 的表达
                               R：CCCAGTCTTGTACTCAGCAAC          与肿瘤分期（Ⅲ/Ⅳ期与Ⅰ/Ⅱ期比较，P=0.006，图
               CDK6            F：CCAGATGGCTCTAACCTCAGT
                                                                1B）和淋巴结状态（阳性与阴性比较，P=0.03，图1C）
                               R：AACTTCCACGAAAAAGAGGCTT
                                                                相关，肿瘤分期高的患者 miR⁃449c 表达低，淋巴结
               β⁃actin         F：GATGAGATTGGCATGGCTTT
                                                                阳性患者 miR⁃449c 表达低。生存分析显示，miR⁃
                               R：CACCTTCACCGTTCCAGTTT
                                                                449 与肺腺癌患者的 DFS 和 DSS 相关（P=0.012 和
              1.2.6 CCK⁃8实验                                     P=0.011，图 1D、E），低表达提示预后不良。
                  取对数生长期细胞以 5 000 个/孔接种于 96 孔                   2.2 突变和富集分析
              板中，24 h 后转染，每组设 6 个平行孔，分别在转染                           在 miR⁃449c 低表达肺腺癌病例的外显子组中
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