Page 38 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第11期
               ·1510 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年11月


                  干燥综合征（Sjögren’s syndrome，SS）是一种慢              性非肥胖性糖尿病小鼠（7 周龄）购自常州卡文斯
              性炎症性自身免疫病，其特征是泪腺和唾液腺功能                            实验动物有限公司。TGP（宁波立华制药有限公司，
              受损，从而导致口眼干燥 。迄今为止，该疾病尚无                           批准文号：国药准字 H20055058）。抗小鼠 NLRP3、
                                    ［1］
              特异性的治疗方法。当前一些 SS 治疗药物显示出                          ASC 和 Caspase⁃1 抗体（Cell Signaling Technology 公
              一定效果，但也增加了患者感染和罹患恶性肿瘤的                            司，美国）；抗β⁃肌动蛋白（β⁃actin）抗体（武汉赛维尔
              风险 。因此，寻找治疗效果好且不良反应小的药                            生物科技有限公司）；RNA提取试剂盒、逆转录试剂
                  ［2］
              物是临床亟需解决的问题。白芍总苷（total gluco⁃                     盒和 ChamQ Universal SYBR qPCR Master Mix（南京
              sides of paeony，TGP）是中药白芍的主要有效成分，                 诺唯赞生物科技有限公司）。
              主要由芍药苷、羟基芍药苷、芍药花苷、芍药内酯                            1.2  方法
                                        ［3］
              苷、苯甲酰芍药苷等成分组成 。研究表明，TGP具                          1.2.1 动物分组与给药
              有抗炎、护肝及免疫调节等多种作用 ，已成为临床                                采用文献报道的公认SS小鼠模型              ［12］ ，非肥胖性
                                               ［4］
              治疗SS患者的药物之一。                                      糖尿病小鼠作为 SS 模型小鼠。将 7 周龄非肥胖性

                  核苷酸结合寡聚化结构域（nucleotide binding                糖尿病小鼠适应性饲养 1周后，随机分为对照组和
              oligomerization domain，NOD）样受体热蛋白结构域相             TGP 组。TGP 配制成 20 mg/mL 溶液。参照文献报

              关蛋白 3（NOD⁃like receptor pyrin domain containing   道，按照成人与小鼠用药剂量换算系数计算                    ［13］ ，TGP
              3，NLRP3）炎症体是 NOD 样受体家族的重要一员，                      组每日以400 mg/kg TGP溶液（400 μL）灌胃，对照组

              其炎症体由NLRP3、凋亡相关斑点样蛋白（apoptosis⁃                   以等体积PBS灌胃，连续用药4周后处理小鼠。
              associated speck⁃like protein containing a carboxyter⁃  1.2.2 唾液流量测定
              minal CARD，ASC）及半胱氨酸蛋白酶⁃1 前体（pro⁃                      小鼠唾液流量测定方法根据文献报道                  ［14］ ，具体
              Caspase⁃1）组成。被激活的 NLRP3 炎症体可促使                    步骤如下：每只小鼠腹腔注射80 μL 0.14%的戊巴比
              ASC将pro⁃Caspase⁃1切割成Caspase⁃1，继而触发白               妥钠麻醉，麻醉后腹腔注射毛果芸香碱，收集小鼠
              细胞介素（interleukin，IL）⁃1β及IL⁃18的释放，引起炎              15 min分泌的唾液。
              症反应   ［5-6］ 。已有研究显示，NLRP3炎症体及下游因子                 1.2.3 颌下腺病理
              在SS患者的外周血单个核细胞、泪液和眼结膜印迹细                               小鼠处死后取颌下腺，于 4%多聚甲醛中固定
              胞中表达上调      ［7-8］ 。有证据表明，在重症SS患者的血清               过 夜 ，然 后 制 作 石 蜡 切 片 ，采 用 苏 木 精 和 伊 红
              中存在炎性DNA积聚以及DNA降解受损。此外，重                          （H&E）染色，并在显微镜下观察和拍照。
              症SS患者外周血单个核细胞和唾液腺巨噬细胞均表                           1.2.4  实时荧光定量PCR（RT⁃qPCR）法检测mRNA
              现出NLRP3炎症体的激活，这可能与炎性DNA积聚                         水平
                  ［9］
              有关 。一项关于SS合并非霍奇金淋巴瘤患者的研                                取适量脾脏组织，加1 mL TRIzol，提取总RNA；将
              究显示，SS患者唾液腺中P2X7、NLRP3、Caspase⁃1和                 总RNA逆转录成cDNA；采用RT⁃PCR法，以GAPDH
              IL⁃18表达量均显著高于对照组 。以上研究结果说                         为内参，检测NLRP3、Caspase⁃1及ASC的表达。PCR
                                         ［10］
              明SS的发病机制与NLRP3炎症体密切相关。                            引物由金斯瑞生物科技有限公司合成：GAPDH 上
                  脾脏是机体重要的免疫器官，研究发现脾脏细                          游引物序列 5′⁃AACGGATTTGGCCGTATTGG⁃3′，下
              胞的炎症体激活后，会释放IL⁃1β、IL⁃18以及肿瘤坏                      游 引 物 序 列 5′⁃CATTCTCGGCCTTGACTGTG⁃ 3′ ；
              死因子⁃α（tumor necrosis factor⁃α，TNF⁃α）等  ［11］ 。然    NLRP3 上游引物序列 5′⁃GTGTGGAT⁃CTTTGCTGC⁃
              而，TGP是否通过抑制脾脏NLRP3炎症体激活发挥                         GAT ⁃ 3′ ，下 游 引 物 序 列 5′ ⁃ TCTTCA ⁃ AGGCT⁃
              免疫调节作用尚不清楚。本研究以雌性非肥胖性                             GTCCTCCTG ⁃ 3′ ；Caspase ⁃ 1 上 游 引 物 序 列 5′ ⁃
              糖尿病小鼠为实验对象，观察TGP对SS小鼠的抗炎                          TCATTTCCGCGGTTGAATCC⁃3′，下游引物序列 5′⁃

              效果，并探索了TGP在体内外对SS小鼠脾脏NLRP3                        CCAACAGGGCGTGAATACAG⁃3′；ASC 上游引物序
              炎症体的调节作用。                                         列 5′⁃GGCTGGCCTAAC ⁃TCAAGAGA⁃3′，下游引物
                                                                序列5′⁃GATGCCCTCTTCTGGCTTTG⁃3′。
              1  材料和方法
                                                                1.2.5 蛋白印迹（Western blot）法检测蛋白表达
              1.1  材料                                                提取小鼠脾脏总蛋白，然后加入上样缓冲液，
                  无特定病原体（specific pathogen free，SPF）级雌          100 ℃加热样本15 min直至蛋白变性。每组取蛋白
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