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第43卷第11期
               ·1516 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年11月


              作用机制。                                             度计对每个样品的 RNA 浓度和纯度进行检测。根
                                                                据反转录试剂盒说明书制备 cDNA；根据 RT⁃qPCR
              1  材料和方法
                                                                试剂盒说明书进行 PCR 扩增反应。依据熔解曲线
              1.1  材料                                           进行产物的特异性分析。U6 作为内参，采用 2                    -ΔΔCT
                  永生化小鼠足细胞（MPC5）由南京医科大学第                        法计算tRF⁃011690相对表达量。β⁃actin作为内参，
              二附属医院肾脏病研究中心馈赠。ADR 和 mTOR                         采用2   -ΔΔCT 法计算p62、LC3和p⁃mTOR mRNA的相对
              特异性磷酸化抑制剂雷帕霉素（Rapamycin）（Med                      表达量。各样本均设置 3 个复孔，实验重复 3 次。
              Chem Express公司，美国）；干扰素（interferon，IFN）⁃γ          目的基因引物序列见表1。
             （Pepro Tech公司，美国）；tRF⁃011690 mimic试剂盒、
              RT⁃qPCR 试剂盒及 U6、tRF⁃011690 引物（广州锐博                                表1  PCR引物序列
              生物科技有限公司）；Lipofectamine 2000 转染试剂、                  目的基因                 引物序列（5′→3′）
              Opti ⁃ MEM 试 剂 及 Trizol 试 剂（Invitrogen 公 司 ，美       LC3          F：GCAGCCTGGATGTTCAGAAT
                                                                               R：TGGATTGCCTGAGACTCCTT
              国）；β⁃actin和p62抗体（Affinity Biosciences公司，美
                                                                  p62          F：ACCCATCCACAGGTGAACTC
              国）；LC3Ⅱ/Ⅰ和 p⁃mTOR 抗体（Cell Signaling 公司，
                                                                               R：GTGGGAGATGTGGGTACAGG
              美国）；羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗（南京凯基生物技
                                                                  mTOR         F：TCCTGAAGAACATGTGCGAG
              术有限公司）。β⁃actin、p62、LC3和mTOR的PCR引
                                                                               R：CCAAAGTACAAGCGAGAGGC
              物由上海锐真生物公司合成。                                       β⁃actin      F：CATCCGTAAAGACCTCTATGCCAAC
              1.2  方法                                                          R：ATGGAGCCACCGATCCACA
              1.2.1 细胞培养
                  MPC5细胞在含10%胎牛血清、1%双抗（青霉素                      1.2.5 Western blot法检测目的蛋白表达水平
              100 U/mL、链霉素100 U/mL）及1%IFN⁃γ（10 U/mL）的                收集干预完成的足细胞，弃去培养基，PBS冲洗
              RPMI⁃1640 培养基中培养，置于 33 ℃、5% CO2的细                 后置于 4 ℃冰上，加入 RIPA 及蛋白酶抑制剂 PMSF
              胞培养箱内；每隔1~2 d换液，镜下视野细胞融合至                         进行裂解，细胞刮刮下细胞移至 1.5 mL EP 管中，冰
              80%~90%时进行传代，置于不含双抗和 IFN⁃γ的完                      上裂解 40 min，4 ℃、12 000 r/min 离心 30 min，取上
              全培养液，放入 37 ℃、5% CO2的细胞培养箱内分化                      清，BCA法测蛋白浓度。每组蛋白上样量为25 μg，经
              10~14 d；每隔1~2 d更换培养液1次，待细胞融合率                     SDS⁃PAGE 电泳、转膜、5%脱脂牛奶封闭 2 h，分别
              为60%~70%时更换无血清培养基继续培养12 h使细                       加入β⁃actin、p62、LC3Ⅱ/Ⅰ和 p⁃mTOR 一抗（稀释比
              胞同步化，收集细胞以备后续实验。                                  例为1∶1 000），4 ℃孵育过夜，TBST洗膜后加入相应
              1.2.2 tRF⁃011690过表达转染                             二抗（稀释比例为 1∶3 000），室温下置于摇床孵育
                  将对数生长期足细胞接种至 6 孔板，按脂质体                        1 h，洗膜 3 次，ECL 显色液显影，凝胶成像仪曝光。
              转染试剂 Lipofectamine 2000 操作说明书操作，用                 Image J软件分析灰度值，以β⁃actin为内参计算目的
              50 nmol/L 的tRF⁃011690 mimic 和tRF⁃011690 NC 以      蛋白表达量。实验重复3次。
              及 Lipofectamine 2000 转染试剂转染细胞。培养 4~               1.3 统计学方法
              6 h后，更换完全培养基用ADR干预24 h。                                采用 GraphPad Prism 8 软件进行统计学分析，
              1.2.3 细胞干预实验                                      数据用均数±标准差（x ± s）表示，用t检验进行两组间
                  观察过表达tRF⁃011690对足细胞自噬的影响，                     比较，采用单因素方差分析（One⁃way ANOVA）进行
                                  ［10］
              细胞用ADR（1 μg/mL） 干预，分为Control组、ADR                 多组间比较分析。P < 0.05为差异有统计学意义。
              组、ADR+tRF⁃011690 mimic 组和 ADR+tRF⁃011690
                                                                2   结   果
              NC组。观察阻断mTOR信号通路对tRF⁃011690及
              足细胞自噬的影响，用ADR（1 μg/mL）与 Rapamycin                 2.1  过表达tRF⁃011690对足细胞自噬的影响
                         ［12］
             （200 ng/mL） 干预，分为 Control 组、ADR 组、ADR+                  RT⁃qPCR 结果表明，与 Control 组相比，ADR 组
              Rapamycin组与Rapamycin组。                            的 tRF⁃011690 表达水平显著降低（P < 0.05）。与
              1.2.4 RT⁃qPCR检测目的基因的表达水平                          ADR 组及 ADR+tRF⁃011690 NC 组相比，ADR+tRF⁃
                  用 Trizol 试剂盒提取各组总 RNA，利用分光光                   011690 mimic 组 tRF⁃011690 表达显著升高，证明
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