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第43卷第3期 王一凡，谢金玉，陈迎玉，等. STK25在星形胶质细胞活化和EAE小鼠病变进程中的作用［J］.
2023年3月 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（3）：311-318 ·313 ·
慢病毒悬液按照1×10 TU/只，经尾静脉注射入小鼠 0 分，无临床症状；1 分，小鼠尾部张力降低或麻痹；
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体内，7 d 后提取小鼠腰段脊髓组织总蛋白质，通过 2分，单侧或双侧后肢不完全麻痹（后肢轻瘫）；3分，
Western blot检测STK25的表达。 后肢完全瘫痪；4 分，后肢瘫痪和单/双侧前肢麻
1.2.3 实验分组与EAE小鼠模型制备 痹；5 分，濒死或死亡。
C57BL/6 小鼠随机分为 4 组：正常对照（normal 1.2.4 Western blot实验
control，NC）组、EAE组、LV⁃ctrl+EAE 组、LV⁃STK25⁃ 参考本实验室已建立的方法 ［10］ ，提取小鼠腰段
shRNA+EAE组。参照本实验室已建立的方法 ，将 脊髓组织总蛋白质，BCA 法测定样品中蛋白质浓
［9］
敲减与对照慢病毒悬液按照1×10 TU/只，经尾静脉注 度，按每孔 50 μg 蛋白上样、电泳、转膜、封闭，一抗
7
射入小鼠体内，7 d后制备EAE小鼠模型：每0.1 mL无 4 ℃摇床孵育 12 h、洗膜，二抗室温孵育 90 min、洗
菌PBS溶液溶解300 μg MOG35⁃55多肽抗原，每0.1 mL 膜，化学发光法显色，以GAPDH为内参。
完全弗氏佐剂溶解 0.5 mg 灭活分枝杆菌 H37Ra 干 1.2.5 Real⁃time PCR实验
粉，将二者充分混合，制成油包水抗原诱导乳剂，沿 用 TRIzol 试剂提取小鼠腰段脊髓组织总 RNA，
小鼠脊髓正中线多点注射入小鼠背部皮下。在注 分光光度计检测RNA浓度，逆转录为cDNA，实时荧
射抗原诱导乳剂的第 0 天和第 2 天，向小鼠腹腔注 光定量 PCR 仪扩增目的基因，以β⁃actin 为内参，校
射200 ng百日咳毒素。在抗原诱导后，每日观察小 正每个样本目的基因的Ct值，以2 -ΔΔCt 值计算基因的
［9］
鼠行为改变，用双盲法进行临床神经功能评分 ： 相对表达水平，每组实验重复3次，引物序列见表1。
表1 Real⁃time PCR引物序列
Table 1 Primer sequences used in real⁃time PCR
基因 上游引物（5′→3′） 下游引物（5′→3′）
STK25 CTGCACTGGACTTGCTGAAAC GGACCAGATGTCAGCCTTGAA
TNF⁃α CCACCACGCTCTTCTGTCTACTG GCCATAGAACTGATGAGAGG
IP⁃10 CGTCATTTTCTGCCTCATCCT TGGTCTTAGATTCCGGATTCAG
GAPDH CCTTCATTGACCTCAACTAC GGAAGGCCATGCCAGTGAGC
1.2.6 免疫荧光 以均数±标准差（x ± s）表示。两组之间比较采用两
将小鼠麻醉后用生理盐水与 4%多聚甲醛灌 独立样本 t 检验，多组之间比较采用单因素方差分
注，取腰段脊髓置于4%多聚甲醛中进行后固定，然后 析（one⁃way ANOVA），两两比较采用 LSD⁃t 检验，
依次放入15%、30%蔗糖溶液进行梯度沉糖。待组织 P < 0.05为差异有统计学意义。
完全沉降后取出，用OCT包埋并冰冻切片（10 μm）。
2 结 果
将脊髓切片依次用 0.4%Triton X⁃100 破膜，10%山
羊血清封闭，加入抗 GFAP 和抗 STK25 抗体，4 ℃冰 2.1 EAE小鼠脊髓STK25表达下降，促炎因子与趋
箱孵育过夜，次日室温复温，PBS 洗涤，再加入相 化因子转录水平升高
应荧光二抗孵育 2 h、PBS 洗涤，加入 DAPI 染色 为了探究EAE小鼠体内STK25的表达变化，使
10 min，PBS 洗涤后滴加抗淬灭剂封片，荧光显微 用 MOG35-55免疫 C57BL/6 小鼠制备 EAE 模型后，取
镜下观察。 小鼠腰段脊髓提取总 RNA 与总蛋白。Real⁃time
1.2.7 HE和LFB染色 PCR 与Western blot结果显示，与NC组相比，EAE组
将小鼠麻醉后用生理盐水与 4%多聚甲醛灌 小 鼠 脊 髓 中 STK25 mRNA 转 录 水 平 显 著 降 低 ，
注，取腰段脊髓置于4%多聚甲醛中进行后固定，依 STK25蛋白表达明显下调（图1A、B）。此外，EAE组
次置于 70%、80%、90%、95%、100%乙醇中脱水，使 小鼠脊髓组织及血清中炎性因子肿瘤坏死因子⁃α
用二甲苯透明后进行石蜡包埋切片（4 μm），苏木素⁃ （tumor necrosis factor⁃α，TNF⁃α）与趋化因子干扰素
伊红（HE）及LFB染色，观察小鼠脊髓炎症细胞浸润 诱导蛋白⁃10（interferon⁃inducible protein⁃10，IP⁃10）
与髓鞘脱失情况。 的转录与分泌水平明显升高（图 1C~F），提示，
1.3 统计学方法 STK25 可能参与 EAE 的病变并负向调控炎性因子
采用GraphPad Prism 8.3进行统计学分析，数据 的生成。
