Page 22 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第3期
·312 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年3月

while the levels of inflammatory cytokines and chemokines were significantly increased. Moreover，the expression of STK25 in
astrocytes in spinal cord was significantly reduced. The expression of STK25 in astrocytes was decreased after stimulated by IFN⁃γ in

vitro，and the production of inflammatory cytokines were increased. After specific knocking down endogenous STK25 in astrocyte，the
production of inflammatory cytokines and chemokines in vitro astrocytes and in vivo EAE mice were increased significantly，which
exacerbated the inflammatory cell infiltration and myelination of spinal cord tissue in EAE mice. Conclusion：STK25 may participate
in the pathological process of EAE mice by affecting the activation of astrocytes and regulating the production of inflammatory
cytokines and chemokines.
［Key words］ serine/threonine protein kinase 25；astrocyte；experimental autoimmune encephalomyelitis；inflammatory cytokine
［J Nanjing Med Univ，2023，43（03）：311⁃318］

多发性硬化（multiple sclerosis，MS）是中枢神经 TRIzol试剂（Thermo Fisher 公司，美国）；髓鞘少
系统（central nervous system，CNS）的慢性进行性自身 突胶质细胞糖蛋白35⁃55（myelin oligodendrocyte gly⁃
免疫性疾病，以免疫细胞浸润脊髓白质引起的炎症反 coprotein 35⁃55，MOG35- 55 ）多肽（上海强耀生物公
应、轴突损伤、脱髓鞘病变为主要特征 。实验性自 司）；逆转录试剂（TaKaRa 公司，日本）；Real⁃time
［1］
身免疫性脑脊髓炎（experimental autoimmune enceph⁃ PCR 试剂（南京诺唯赞生物技术有限公司）；结核分
［2］
alomyelitis，EAE）是公认的研究MS的理想模型 。研 枝杆菌 H37Ra 干粉（Difco 公司，美国）；完全弗氏佐
究表明，在 EAE 中，活化的星形胶质细胞通过释放 剂（Sigma公司，美国）；百日咳毒素（Invitrogen公司，
炎症因子与趋化因子，募集炎症细胞浸润至CNS，加 美国）；STK25抗体（Cell Signaling Technolog 公司，美
剧血脑屏障损伤，在疾病的发生发展中发挥关键作 国）；胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic pro⁃
［3］
用 ，但其在MS/EAE中的具体作用机制尚不明确。 tein，GFAP）抗体和劳克坚牢蓝染色（Luxol fast blue，
丝 氨 酸/苏 氨 酸 蛋 白 激 酶 25（serine/threonine LFB）染液（Abcam 公司，英国）；特异性靶向星形胶
protein kinase 25，STK25）是哺乳动物不育系20样激 质细胞的 STK25 敲减（LV⁃STK25⁃shRNA）及阴性对
酶（mammalian sterile⁃20⁃like，MST）家族的一员，可 照（LV⁃ctrl）的慢病毒载体的构建与包装，由上海吉
使下游相关信号蛋白丝氨酸、苏氨酸残基发生磷酸 凯公司完成。
化，激活相关转录因子，并参与协同刺激信号的转导， 1.2 方法
在神经系统发育、神经炎症中发挥重要作用 ［4-5］ 。研 1.2.1 重组慢病毒载体的构建、包装及原代星形胶
究表明，STK25 与人类中枢神经系统的发育高度相 质细胞的慢病毒感染实验
［6］
关，敲除STK25会直接影响胚胎神经元的发育 ；而 特异性靶向星形胶质细胞的慢病毒载体构建、
［9］
STK25基因缺失会导致一系列神经功能障碍性疾病 包装参照本课题组刘晓梅等 的方法。构建携带
的发生 。研究指出，STK25 可在自身免疫性疾病 GFAP 启动子的 STK25 敲减的重组慢病毒表达载
［7］
［8］
及神经系统炎症中发挥重要作用 ，但STK25在MS/ 体，并进行慢病毒的包装与滴度测定。将传至 3 代
EAE 中的作用及其对活化星形胶质细胞的影响尚 的星形胶质细胞接种到 6 孔板，细胞汇合度在 80%
无文献报道。本研究通过构建特异性靶向星形胶 左右时，将慢病毒悬液 30 μL 加入到 1 mL 含 10%
质细胞的 STK25 敲减的重组慢病毒载体，探讨 FBS无抗生素的DMEM/F12培养基，并加入polybrene
STK25对于活化的星形胶质细胞炎性因子和趋化因 （终浓度为5 μg/mL），移去细胞培养液，每孔加入病
子生成的影响及其在EAE中的作用。 毒稀释液，37 ℃、5%CO2培养 12~24 h；移去细胞侵
染后的病毒液，加入 1 mL 含 10%FBS 无抗生素的
1 材料和方法
DMEM/F12完全培养液，37 ℃、5%CO2条件下继续培
1.1 材料 养72 h，荧光显微镜观察病毒的感染效率。然后，干
6~8 周龄的 C57BL/6 雌性小鼠购自南京大学模 扰素（interferon，IFN）⁃γ刺激星形胶质细胞，检测相
式动物中心。研究中对实验动物所实施的方法均 关指标的变化。
根据中国实验室协会的规定和建议进行，并获得徐 1.2.2 质粒有效性验证
州医科大学实验动物伦理委员会的批准。 参照本实验室已建立的方法 ，将敲减与对照
［9］