Page 56 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第4期
·494 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年4月

国）。HERAcell 240i CO2 细胞培养箱、Nano⁃Drop 中提取总 RNA，Nano⁃Drop ND⁃2000 分光光度计测
ND⁃2000分光光度计（Thermo Fisher Scientific 公司， 量其在 260 nm 与 280 nm 处的吸光度比值，确认总
美国）；ABI Prism 7500 型荧光定量 PCR 仪（应用 RNA 的纯度及浓度。使用 PrimeScript RT 试剂盒
®
TM
生物系统公司，美国）；iMark680 多功能酶标仪 将总 RNA（1 μg）逆转录为 cDNA。使用该 cDNA
（Bio⁃Rad 公司，美国）；Ts2⁃FC 倒置荧光显微镜 作为模板，在荧光定量 PCR 系统上进行 RT⁃qP⁃
（Nikon公司，日本）。 CR。热循环条件如下：95 ℃预变性 10 min；然后
1.2 方法 95 ℃变性 15 s 和 60 ℃退火 1 min，40 个循环。采用
1.2.1 实时荧光定量PCR（quantitative real⁃time PCR， 2 -ΔΔCt 方法进行相对定量分析，lnc⁃NEAT1 和 CSPG4
RT⁃qPCR）检测mRNA表达 的相对表达标准化为 GAPDH，U6 作为 miR⁃29c⁃3p
使用 TRIzol 试剂从 HEMa⁃LP 细胞和 MM 细胞 的内部对照。

表1 用于RT⁃qPCR的引物序列
Table 1 Primer sequences used for RT⁃qPCR
基因 正向引物（5′→3′） 反向引物（5′→3′）
人lnc⁃NEAT1 AATGCTTGTTCCAGAGCCCA AAGAAGGCAGGCAAACAGGT
小鼠lnc⁃NEAT1 TGAGTAGTGGAAGCAGGAGGAT GGAGGCAAGGACGAGACAGA
人miR⁃29c⁃3p CTGACCTTAGCACCATTTGAAATC TATCGTTGTACTCCACTCCTTGAC
小鼠miR⁃29c⁃3p GAAGCACCATTTGAAATCAG TTGGCACTAGCACATT
人CSPG4 CCTCCTGCTGCAGCTCTACT CTGAGGAGGCGTTCAGAAAC
小鼠CSPG4 TCTTACCTTGGCCCTGTTGG ACTCTGGTCAGAGCTGAGGG
人GAPDH ACGGATTTGGTCGTATTGGG TGATTTTGGAGGGGATCTCGC
小鼠GAPDH GAGTCCACTGGCGTCTTCAC ATCTTGAGGCTGTTGTCATACTTCT
人U6 CTCGCTTCGGGCAGCACA AACGCTCTCACGAATTTGCGT
小鼠U6 CTTCACGAATTTGCGTGTCAT GCTTCGGCAGCACATATAC

1.2.2 细胞转染 200 μL 二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide，DMSO），使
B16 细胞接种于 6 孔板中（5×10 个/孔），当细 用酶标仪记录490 nm处的光密度值。
4
胞融合 80%以上时，进行转染。实验分为（control 1.2.4 Transwell小室检测细胞迁移和侵袭能力
对照组，不进行任何转染）、si⁃NC 组（转染si⁃NEAT1 通过 Transwell 24 孔室检查细胞迁移和侵袭能
阴性对照 si⁃NC）、si⁃NEAT1 组（转染 si⁃NEAT1）、 力。对于迁移能力测定，细胞转染 48 h 后，制备无
si⁃NEAT1+inhibitor⁃NC 组（共转染si⁃NEAT1和miR⁃ 血清细胞悬液，然后将 200 μL 无血清细胞悬液（2×
4
29c⁃3p inhibitor 阴性对照 inhibitor⁃NC）、si⁃NEAT1+ 10 个/孔）接种到 Transwell 小室（8 μm 孔径）的上室
miR⁃29c⁃3p inhibitor组（共转染si⁃NEAT1和miR⁃29c⁃ 中，同时将500 μL含有10%胎牛血清的DMEM培养
3p inhibitor）。使用Lipofectamine 3000将si⁃NEAT1、 基添加到下室。随后，在37 ℃下孵育48 h。将迁移
miR⁃29c⁃3p inhibitor 及其阴性对照转染相应孔中的 到膜下表面的细胞用 4%多聚甲醛固定 5 min，再用
细胞。si⁃NEAT1的转染浓度为50 nmol/L，miR⁃29c⁃ 0.1%结晶紫染色 10 min，随机选择 5 个视野在倒置
3p inhibitor的转染浓度为100 nmol/L。转染6 h后更 显微镜下计数细胞并拍摄图像。对于侵袭能力测
换培养液，然后在37℃、5% CO2下常规培养48 h，用 定，Matrigel 胶预先涂在 Transwell 小室的上室中，并
RT⁃qPCR 检测转染效率，收集转染细胞用于下一步 在 37 ℃的培养箱中固化 1 h，其余步骤与迁移能力
分析。 测定的步骤相同。
1.2.3 MTT法检测细胞增殖活力 1.2.5 蛋白质印迹（Western blot）法检测蛋白表达
将细胞以 2×10 个/孔的密度接种到 96 孔板 用 RIPA 裂解缓冲液从 MM 细胞中提取总蛋
3
中，转染 6 h 换液后于 37 ℃下孵育 0、24、48、72 h。 白，BCA 法测定蛋白浓度。然后将蛋白质经 10%，
在设定的时间点向每个孔中加入 20 μL MTT 溶 SDS⁃PAGE分离并转移到聚偏二氟乙烯（polyvinylidene
液（5 μg/mL），在 37 ℃下孵育 4 h。然后每孔加入 fluoride，PVDF）膜上。膜用 5%脱脂牛奶封闭后，在