Page 57 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 57

第43卷第4期         谢 奇，樊鑫梅，韩永红，等. lnc⁃NEAT1通过miR⁃29c⁃3p/CSPG4信号轴调节黑色素瘤B16细
                  2023年4月           胞的增殖、迁移和侵袭［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（04）：492⁃501                  ·495 ·


                4 ℃下与一抗孵育过夜。使用的一抗如下：CSPG4                         在室温下用二抗（1∶200）孵育30 min。DAB显色后，
               （1∶1 000）、Ki⁃67（1∶1 000）、E⁃cadherin（1∶1 000）、      用苏木精复染 30 s。在光学显微镜下观察组织切，
                N⁃cadherin（1∶1 000）、Vimentin（1∶1 000）和 GAPDH      并用 Image⁃Pro Plus 6.0 软件计算 Ki⁃67 阳性表达的
               （1∶3 000）。然后在室温下，将膜与辣根过氧化物酶                        积分光密度（integral optical density，IOD）。
                偶联山羊抗兔IgG二抗（1∶5 000）孵育1 h。最后，通                    1.3  统计学方法
                过增强化学发光试剂进行显色反应，使用Image J软                            采用 GraphPad Prism 8.0 软件进行统计分析。
                件观察并量化蛋白质条带。                                      计量数据均符合正态分布，以均数±标准差（x ± s）表
                1.2.6  双荧光素酶报告基因检测                                示。多组间比较采用单因素方差分析，组间多重比

                    使用生物信息学 StarBase v2.0 数据库（https：//            较用SNK⁃q检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
                starbase.sysu.edu.cn/index.php）和 TargetScan Humam
                                                                  2 结    果
                7.2（http：//www.targetscan.org/vert_72/）分析预测 miR
                ⁃29c⁃3p 与 lnc⁃NEAT1 和 CSPG4 的结合位点。将野              2.1  MM 细胞中 lnc⁃NEAT1、miR⁃29c⁃3p 和 CSPG4
                生型（WT）和突变型（MUT）lnc⁃NEAT1 的序列克隆                    mRNA水平比较
                到pGL3载体中，构建NEAT1⁃WT 和NEAT1⁃MUT 质                      与HEMa⁃LP相比，MM细胞系（A375、A875、M14、
                粒。类似地，构建了 CSPG4⁃WT 和 CSPG4⁃MUT 质                  B16）中 lnc⁃NEAT1 和 CSPG4 mRNA 水平显著升高
                粒。将 B16 细胞接种在 24 孔板中，培养至 80%汇                    （P < 0.05），miR⁃29c⁃3p水平显著降低（P < 0.05），其
                合时，使用 Lipofectamine 3000 转染试剂将这些重                 中，B16 细胞中 lnc⁃NEAT1 和 CSPG4 mRNA 水平均
                组荧光素酶报告质粒分别与 miR⁃29c⁃3p mimic 或                   高于其他MM细胞（P < 0.05，表2）。因此，选择B16
                miR⁃NC共转染到B16细胞中。转染48 h后，用PLB                     细胞用于后续实验。
                细胞裂解缓冲液裂解细胞。然后，通过双荧光素酶
                                                                  表2 MM细胞中lnc⁃NEAT1、miR⁃29c⁃3p和CSPG4 mRNA
                报告基因系统检测B16细胞裂解物中萤火虫和海肾
                                                                       水平比较
                的荧光素酶活性。将细胞裂解物的相对双荧光素                             Table 2  Comparison of lnc ⁃ NEAT1，miR ⁃ 29c ⁃ 3p and
                酶活性标准化为海肾荧光素酶活性。                                          CSPG4 mRNA levels in MM cells
                1.2.7  裸鼠移植瘤实验                                                                       （x ± s，n=6）
                    20 只雄性 BALB/c 裸鼠（7 周龄，体重 20~22 g）                细胞      lnc⁃NEAT1   miR⁃29c⁃3p  CSPG4 mRNA
                购自北京维通利华实验动物技术有限公司。si⁃NC、                          HEMa⁃LP   1.00 ± 0.00  1.00 ± 0.00  1.00 ± 0.00
                si⁃NEAT1和si⁃NEAT1+inhibitor⁃NC、si⁃NEAT1+miR⁃       B16       3.25 ± 0.39 *  0.34 ± 0.05 *  2.89 ± 0.30 *
                29c⁃3p inhibitor 分别通过慢病毒载体（上海吉玛公                   A875      1.47 ± 0.18 *#  0.80 ± 0.09 *#  1.56 ± 0.21 *#
                司构建）转染 B16 细胞获得稳定表达。将所有裸鼠                          M14       2.04 ± 0.25 *#&  0.51 ± 0.05 *#&  2.03 ± 0.27 *#&
                                                                                     *#&  0.46 ± 0.06 *#&  2.45 ± 0.28 *#&∆
                                                                   A375
                                                                             2.38 ± 0.29
                随机分成 4 组（每组 5 只）：si⁃NC 组、si⁃NEAT1 组和
                                                                     与HEMa⁃LP细胞相比，P < 0.05；与B16细胞相比，P < 0.05；与
                                                                                     *
                                                                                                        #
                si⁃NEAT1+inhibitor⁃NC 组、si⁃NEAT1+miR⁃29c⁃3p
                                                                  A875细胞相比，P < 0.05；与M14细胞相比，P < 0.05。
                                                                             &
                                                                                                ∆
                inhibitor 组，将转染的 B16 细胞悬液（浓度为 2×
                10 个/mL）皮下注射到每只裸鼠的右下腹。每周测                         2.2  转染后各组细胞中 lnc⁃NEAT1、miR⁃29c⁃3p 和
                  7
                量并通过公式计算肿瘤体积（V）：V=（长×宽 ）/2。                       CSPG4水平比较
                                                         2
                4 周后，通过颈椎脱位法处死裸鼠，切除肿瘤。将肿                              与 control 组、si⁃NC 组相比，si⁃NEAT1 组细胞中
                瘤组织称重，一部分用 4%多聚甲醛固定用于免疫                           lnc⁃NEAT1、CSPG4 的 mRNA 和蛋白水平显著降低
                组织化学（IHC）染色，另一部分用于提取总 RNA 和                      （P < 0.05），miR⁃29c⁃3p 水平显著升高（P < 0.05）；
                蛋 白 质 ，通 过 RT ⁃ qPCR 和 Western blot 检 测 lnc ⁃     与 si⁃NEAT1 组 、si⁃NEAT1+inhibitor⁃NC 组 相 比 ，
                NEAT1、miR⁃29c⁃3p和CSPG4水平。                         si⁃NEAT1+miR⁃29c⁃3p inhibitor 组细胞中 CSPG4 的
                1.2.8  IHC法检测肿瘤组织中Ki⁃67阳性表达                       mRNA 和蛋白水平显著升高（P < 0.05），miR⁃29c⁃3p
                    将 4%多聚甲醛固定的肿瘤组织包埋在石蜡中                         水平显著降低（P < 0.05，图1，表3）。

                并切成 4 μm 厚的切片。经脱蜡、水化后，用 0.3%                      2.3  敲低NEAT1对B16细胞增殖活性的影响
                H2O2消除内源性过氧化物酶。5%正常山羊血清封                              在转染后常规培养 48、72 h 时，与 control 组、
                闭后，将切片与 Ki⁃67 抗体（1∶100）孵育过夜，然后                    si⁃NC 组相比，si⁃NEAT1 组细胞增殖活性显著降低
   52   53   54   55   56   57   58   59   60   61   62