Page 66 - 南京医科大学学报自然科学版

第43卷第4期
·504 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年4月

cDNA、引物、双蒸水配制 PCR 体系，实时荧光定量 抗孵育，最后使用ECL发光液进行蛋白条带成像。
PCR 仪（Thermo 公司，美国）进行分析，内参基因选 1.2.8 流式细胞术
择18S rRNA基因，采用2 -ΔΔCT 法计算相对表达量。 收集各组转染 48 h 后的细胞，使用不含 EDTA
1.2.4 CCK⁃8实验 的胰酶消化，离心弃上清，加入 PBS 重悬洗涤两次
将各组转染 48 h 的细胞消化、计数，按照每孔 后加入 500 μL 的染色缓冲液以及 Annexin V⁃FITC
3×10 个的标准将各组细胞接种于 96 孔板中，于接 与 PI 各 5 μL，混匀后室温孵育 15 min，在流式细
3
种后的 0、24、48、72、96 和 120 h 分别按照 CCK⁃8 试 胞仪（BD Biosciences 公司，美国）中进行细胞凋亡
剂盒说明书加入检测溶液，培养1 h后，使用酶标仪 检测。
测定各孔在450 nm处的吸光度值。 1.3 统计学方法
1.2.5 集落形成实验 使用 R 软件（https：//www.r⁃project.org/，4.2.0 版
在 6 孔板中接种上述处理的细胞，按照每孔 本）分析并绘制差异miRNA的火山图及热图。实验
1×10 个标准进行接种，接种后将培养板置于细胞培 数据采用SPSS 23.0软件进行数据分析，每个实验重
3
养箱中培养2周，每3 d进行1次培养基更换，2周后 复 3 次，数据以均数±标准差（x ± s）表示，两组间比
丢弃培养基加入 4%多聚甲醛进行固定，固定完成 较采用t检验，多组间比较采用方差分析，与对照组
后使用结晶紫溶液进行染色，最后使用PBS清洗、干 比较采用Dunnett⁃t检验，组间两两比较采用Tukey’s
燥后进行计数。 检验。P < 0.05为差异有统计学意义。
1.2.6 荧光素酶活性分析
2 结 果
使用含有 miR⁃27b⁃3p 预测结合位点的 SSRP1
定向缺失突变型（SSRP1⁃Mut）和野生型（SSRP1⁃WT） 2.1 miR⁃27b⁃3p在骨肉瘤样本及细胞中显著低表达
3′⁃UTR 的荧光素酶序列报告载体单独转染或与 首先在GEO数据库中的GSE65071数据集使用
miR⁃27b⁃3p mimics 共转染骨肉瘤细胞，细胞裂解 R语言进行差异miRNA分析，标准为 log2FC ≥ 1且
后，按照试剂盒厂家提供的说明，采用酶标仪检测 调整后的 P < 0.05，共获得了 169 个差异 miRNA，包
荧光素酶活性。 括 80 个上调 miRNA 和 89 个下调 miRNA，结果展示
1.2.7 Western blot 在火山图（图 1A）和热图（图 1B），发现 miR⁃27b⁃3p
上述各组转染48 h后的细胞培养板置于冰上， 在骨肉瘤样本中的表达水平显著降低。为了验证
弃培养基，使用预冷的 PBS 冲洗，使用预冷的 RIPA miR⁃27b⁃3p在骨肉瘤细胞是否低表达，使用RT⁃qPCR
裂解液（含蛋白酶抑制剂）进行裂解，收集细胞后 检测 miR⁃27b⁃3p 的表达水平，结果显示，相比于人
高速离心，取上清，BCA 法测定后调整蛋白浓度至 正常成骨细胞株hFOB1.19，miR⁃27b⁃3p在骨肉瘤细
20 ng/mL，100 ℃下的金属浴加热 5 min 获得蛋白样 胞株 U⁃2OS、143B、MG63 及 MNNG⁃HOS 的表达量
品。选择 10%的蛋白胶预混液进行电泳，转膜、封 均显著降低（P < 0.001，图 1C）。由此得出结论，
闭后与特异性一抗在4 ℃摇床上封闭过夜，再加入二 miR⁃27b⁃3p在骨肉瘤样本及细胞中显著低表达。

A B C 1.2

miR⁃27b⁃3p
正常样本
2
20 骨肉瘤 0.8
0 miR⁃27b⁃3p相对表达量 ***
-lgP 下调 -2 0.4 *** ***
10 不变
上调 ***
miR⁃27b⁃3p 0
0 hFOB1.19 U⁃2OS 143B MG63
-4 -2 0 2 4 MNNG⁃HOS
log2FC
A：火山图显示骨肉瘤和正常样本中差异表达的miRNA，绿点和红点分别表示显著下调和上调的miRNA；B：热图显示骨肉瘤和正常样本
中的差异表达的miRNA；C：RT⁃qPCR检测miR⁃27b⁃3p在骨肉瘤各细胞系中的表达水平。与hFOB1.19细胞相比， P < 0.001（n=3）。
***
图1 miR⁃27b⁃3p在骨肉瘤患者样本和细胞系中表达下调
Figure 1 miR⁃27b⁃3p was downregulated in OS patient samples and cell lines