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第43卷第4期            段伟豪，俞学成，吴璟斌，等. miR⁃27b⁃3p通过靶向SSRP1调控骨肉瘤细胞的生长［J］.
                  2023年4月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（04）：502⁃509                       ·503 ·


                    骨肉瘤（osteosarcoma，OS）是人类最早发现的癌                 recognition protein⁃1，SSRP1）小干扰RNA（si⁃SSRP1）
                症之一，也是最常见的原发恶性骨肿瘤之一，但它                            以及 SSRP1 过表达载体及其阴性对照载体均由上
                仍是一种很罕见的恶性肿瘤 。骨肉瘤最常发生于                            海吉玛公司设计并合成；Lipofectamine 3000 试剂
                                         ［1］
                儿童及青少年中，常累及长骨干骺端，如股骨远端                           （Invitrogen 公司，美国）；CCK⁃8 试剂盒、辣根过氧化
                与胫骨近端，且具有很强的肺转移倾向 。随着手                            物酶标记的山羊抗兔二抗（上海圣尔生物）；RIPA裂
                                                   ［2］
                术治疗的发展和多药化疗方案的引入，骨肉瘤患者                            解液、BCA 蛋白定量试剂盒（杭州碧云天）；细胞冻
                的总生存率已经提升至60%~70%，但伴有转移和复                         存液、ECL 发光液（苏州新赛美）；结晶紫染液（北京
                                                      ［3-4］
                发的骨肉瘤患者的 5 年生存率仍仅约 20%                    。而      索莱宝）；PBS 缓冲液、TBS 缓冲液、电泳缓冲液、转
                在过去的三十余年里，骨肉瘤患者的总体生存率达                            膜缓冲液、4%多聚甲醛（武汉赛维尔）；逆转录试剂
                               ［5］
                到了一个平台期 。因此，探寻骨肉瘤的发生发展                            盒、实时荧光定量 PCR 试剂盒、蛋白胶预混液试剂
                机制，找到有效的分子靶点是改善骨肉瘤患者预后                            盒（南京诺唯赞）；NucleoZOL 试剂（Macherey⁃Nagel
                的当务之急。                                            公司，德国）；GAPDH和SSRP1兔多克隆抗体（Abcam
                    微小 RNA（microRNA，miRNA）是一类内源性的                 公司，英国）。
                非编码小分子RNA，大小约为18~25个核苷酸，其主要                       1.2  方法

                功能是识别靶基因的 3′非编码区（3′⁃untranslated                  1.2.1  细胞培养、转染
                region，3′⁃UTR）中的互补靶点，在转录之后抑制靶                         U⁃2OS 及 MG63 细胞株选用 McCoy’s 5A 培养
                                               ［6］
                基因的表达或者促进靶基因的降解 。miRNA已被                          基 ，143B 和 MG63 细 胞 株 选 用 MEM 培 养 基 ，
                证明参与肿瘤的各种生物过程，如增殖、凋亡、侵袭、                          hFOB1.19选用DMEM培养基，均辅以10%的胎牛血
                转移、自噬和血管生成等           ［7-10］ 。大量研究发现，miR⁃         清及1%的青链霉素。人骨肉瘤细胞株均在37 ℃含
                NA 在调节骨肉瘤增殖、迁移、凋亡等方面发挥了关                          5% CO2的湿润气体的培养箱中培养，成骨细胞株在
                键作用，并与骨肉瘤的预后及耐药密切相关，具有                            34.5 ℃含5% CO2的湿润气体的培养箱中培养。
                成为骨肉瘤的新型候选生物标志物的潜力                   ［11-14］ 。越       以上细胞每2 d更换1次细胞培养液，在细胞密
                来越多的证据表明，miR⁃27b⁃3p在肿瘤组织中表达                       度达到80%时使用胰酶进行消化与传代。转染48 h
                下调  ［15］ ，并作为一种肿瘤抑制因子调节肿瘤进展，                      后取适量对数生长期的细胞进行铺板，当孔内细胞
                包括细胞增殖、侵袭、转移等方面             ［16-18］ 。同时，也有研       密度达到70%~90%时进行质粒转染，转染方法按照
                究证明了 miR⁃27b⁃3p 可能作为一种致癌 miRNA 促                  Lipofectamine 3000提供的方法进行。
                              ［19］
                进乳腺癌的生长 。这些研究的发现说明miR⁃27b⁃                        1.2.2  GEO数据库分析
                3p可能具有多方面的作用，可能与特定的肿瘤类型                               GSE65071 数据集从 GEO 数据库（http：//www.
                或者具体的靶基因有关。然而，miR⁃27b⁃3p在骨肉                       ncbi.nlm.nih.gov/geo）获取，使用R语言limma包分析
                瘤中的生物学功能尚未被研究。                                    并筛选该数据集中正常样本与骨肉瘤样本的差异
                    本研究旨在探寻骨肉瘤中差异表达的miR⁃27b⁃3p                    表达的 miRNA［标准为 log2 差异倍数（fold change，
                在骨肉瘤发生发展中的表达情况、生物学功能以及                            FC）≥ 1 且调整后的 P < 0.05］，分别运用 R 语言的
                潜在的分子机制，从而为骨肉瘤的治疗提供新的思                            ggpubr 和 pheatmap 包对差异 miRNA 绘制火山图及
                路和靶点。                                             热图。GSE65071 数据集中包括 35 例样本，其中
                                                                  20 例骨肉瘤样本为肿瘤组，15 例健康者样本为对
                1 材料和方法
                                                                  照组。
                1.1  材料                                           1.2.3  实时荧光定量PCR（RT⁃qPCR）

                    人骨肉瘤细胞株U⁃2OS、143B、MG63、MNNG⁃HOS                   使用上述转染48 h的细胞，根据厂商提供的说
                以及人成骨细胞系 hFOB1.19 购自中国科学院上海                       明使用 NucleoZOL 试剂进行细胞总 RNA 的抽提。

                生命科学研究所细胞库。MEM、DMEM、McCoy’s                       使用酶标仪（BioTek公司，美国）测定总RNA的浓度
                5A培养基、胰酶、青链霉素（双抗）（上海源培生物）；                        及纯度。取 1 000 ng RNA 使用逆转录试剂盒，按照
                胎牛血清（Gibco 公司，美国）；miR⁃27b⁃3p 模拟物                  10 μL 的体系配方进行 cDNA 合成，反应条件为

               （miR⁃27b⁃3p mimics）、miR⁃27b⁃3p对照载体（mimics          42 ℃ 30 min，95 ℃ 5 min，5 ℃ 5 min，获得的 cDNA
                control）、结构特异性识别蛋白 1（structure⁃specific           置于-20 ℃保存。使用实时荧光定量 PCR 试剂盒、
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