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第43卷第5期 赵舒怡，裘冯卓，史明超，等. 自体外周单核细胞治疗肌萎缩侧索硬化疗效及外周淋巴细胞变化观察［J］.
                  2023年5月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（5）：701-707                        ·703 ·


                规进行。整个试验由医院指定的第三方监察员安排、                           到胎牛血清输入人体后可能会影响患者，回输前的
                控制。                                               最后 2 次培养将 10％胎牛血清更换为 15％患者本
                1.2  方法                                           人的自体血清。
                1.2.1 PBMC的采集                                     1.2.3 体外扩增培养PBMC的自体回输
                    入组患者需进行五项检测（血常规、尿常规、梅                             PBMC体外扩增培养6周后，经含20%人体白蛋
                毒抗体、HIV抗体、乙型肝炎五项），确定合格后由医                         白的 PBS 液洗涤 3 次，再次进行细胞鉴定及纯度测
                院输血科通过一次性采血袋（内含抗凝剂）采集外                            定，按 1×10 个/kg 体重取 PBMC 细胞置于 20%人体
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                周血100 mL，充分混合并于2 h内进行PBMC分离。                      白蛋白100 mL中，然后装入200 mL输血袋；对照组
                    在锂肝素管（Sarstedt公司，德国）中收集外周血                    使用的输血袋装入 100 mL 20%人体白蛋白（安慰

                样本（PBMC 组 15 例和对照组 13 例）。通过 Ficoll⁃               剂）用于对照。两组液体在外观、透明度、包装上完
                Hypaque（Biochrom 公 司 ，英 国）密 度 离 心 制 备             全一致。由床位护士直接到输血科领取并在30 min

                PBMC，然后用磷酸盐缓冲液（phosphate buffer solu⁃             内输入受试者体内。
                tion，PBS）洗涤并手动计数        ［13］ 。将用于细胞因子分            1.2.4 质控
                析的血清样品收集在7.5 mL管中，并在2 000 g下离                         出于质控需要，每位受试者在每次回输前均需
                心 10 min，等分并在收集后 20 min 内在-80 ℃下冷                 留存 0.5 mL 液体送检病原微生物（细菌、病毒、真
                冻。①稀释：取50 mL离心管，在室温下加入等体积                         菌）检测及内毒素检测，用同一支 20％人体白蛋白
                的RPMI 1640培养液（含10%胎牛血清），轻轻吹打混                     0.5 mL作为阴性对照。
                匀；②加样：再取50 mL离心管，用移液管吸取15 mL                      1.2.5 ALSFRS⁃R评分
                淋巴细胞分离液放到离心管里，保持管45°倾斜，把                              患者的病情进展由ALSFRS⁃R评估。每位入组
                经过稀释的血液于Ficoll 液面上方顺着管壁缓慢添                        患者均由专科医生在治疗前、治疗后第 5 天与第
                加 至 Ficoll 上 ；③ 离 心 ：设 置 参 数 18~20 ℃ ，1           14 天进行 ALSFRS⁃R 评分并记录得分。ALSFRS⁃R
                500 r/min，20 min（在降速的时候应将刹车关闭），离                  量表总分48分，包括语言、流涎、吞咽、书写、切割食
                心后管中液体从管底至液面分 4 层：依次为红细胞                          物、着装和卫生、床上翻身、行走、上楼、呼吸困难、
                和粒细胞层、分层液层、云雾层（PBMC）、血浆层；④                        端坐呼吸、呼吸功能不全等 12 个评估项目，得分越
                回收：在云雾层中插入巴氏管，将其中的云雾层吸                            低，病情越重。
                出后转入到新离心管中，动作轻柔；⑤洗涤：向其中加                          1.2.6  荧光激活细胞分选（fluorescence activating
                入一定量RPMI 1640培养液（至少大于PBMC体积 3                     cell sorter，FACS）的免疫细胞表型
                倍，含10%胎牛血清），18~20 ℃，1 500 r/min，5 min，重               取 5 mL 新鲜外周血制备的 PBMC，采用荧光标
                复1~2次。                                            记 抗 CD3、抗 CD4、抗 CD8、抗 CD14、抗 CD25、抗
                1.2.2 PBMC的体外扩增培养                                 CD16、抗 CD56（MiltenyiBiotec 公司，德国）对 T 细胞
                    ①激活：将分离成功的 PBMC 接种于 25 cm 培                   和NK细胞亚群进行表面染色。阴性对照包括直接
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                养瓶中，每个培养瓶中含 10 mL RPMI 1640 培养液                   标记或未标记的同种型匹配的不相关抗体（BD Bio⁃
               （含 10%胎牛血清，1%青霉素⁃链霉素），10 μL植物血                     sciences 公司，美国）。所有细胞都在 LSR⁃Fortessa
                凝素⁃L（phytohemagglutinin⁃L，PHA⁃L，1.25 μg/mL），     （BD Biosciences 公司，美国）上测量，并由 FACS⁃Di⁃
                25 μL IL⁃2（5×10 U/mL），置于 37 ℃、5%CO 饱和湿            va Software（BD Bioscience公司，美国）进行评估。
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                度培养箱培养。3 d后离心换液；②扩增：取1/6~1/5                      1.2.7 FACS分析的细胞内染色
                细胞继续培养，余冻存。观察培养状况，每隔3~4 d                             为了进一步表征细胞内标志物，将 PBMC 悬浮
                以 RPMI 1640 培养基（含 10%胎牛血清，1%青霉素⁃                  在由 RPMI 1640、5%胎牛血清、2 mmol/L L⁃谷氨酰
                链霉素）和 IL⁃2（5×10 U/mL）换液或添加 1 次，扩增                 胺、100 U/mL 青霉素和 100 μg/mL 链霉素组成的培
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                后的原代细胞计数并鉴定。每份（25 cm 培养瓶）细                        养基中。胞内染色前用2 mL PBS（含0.5％Triton）处
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                胞数量为2×10 个。                                       理细胞 20 min。随后，使用荧光标记的抗 FoxP3 抗
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                                                          ［14］
                    FDA已批准对于人体临床试验使用胎牛血清 ；                        体（MiltenyiBiotec 公司，德国）或同种型匹配的不相
                依据现行药典中关于生物制品标准，国内近年来也                            关抗体（BD Biosciences 公司，美国）对细胞进行染
                在临床用细胞培养方面积累了更多经验                    ［15］ 。考虑     色。染色程序后，通过流式细胞术评估细胞。在
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