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第43卷第5期          施  欣，景蓉蓉，王 洁，等. 环状RNA hsa_circ_0001479在胃癌中的表达及功能研究［J］.
                  2023年5月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（5）：617-625                        ·619 ·


                hsa_circ_0001479 siRNA 转染至 MKN⁃45、BGC⁃823        （图1B）。收集扩增产物进行桑格测序，测序结果见
                细胞株，空载体和 hsa_circ_0001479 pcDNA 转染至               图1C，将其与Circbase数据库中hsa_circ_0001479的
                SGC⁃7901 细胞株。转染 48 h 后通过 RT⁃qPCR 测定               序列进行比对，比对结果100%一致。
                转染后表达。                                                线性范围评价：通过RT⁃qPCR 检测5~7个浓度
                    细胞增殖能力检测：①CCK⁃8实验：取转染48 h                     梯度的样本中 hsa_circ_0001479 和 18 s rRNA 的 CT
                后的细胞接种于 96 孔板中，每组设立 4 个复孔，按                       值，统计分析结果显示，hsa_circ_0001479 线性方程
                说明书操作后，用酶标仪上测定450 nm处各孔的吸                         为 Y=-2.831X+23.65，r =0.999 4；18 s rRNA 的线性
                                                                                      2
                光度值，连续检测5 d并绘制折线图；②克隆形成实                          方程为Y=-2.918X+6.958，r =0.999 2，该定量检测方
                                                                                          2
                验：取转染 48 h 后的细胞以每孔 1 000 个细胞接种                    法线性良好（图2）。
                于 6 孔板中，培养 2 周后出现肉眼可见的细胞克隆                        表1   RT⁃qPCR检测hsa_circ_0001479和18s rRNA的精密
                斑，用甲醛固定 30 min，结晶紫染色 15 min，PBS 洗                      度评价
                涤、晾干后拍照并计数。                                       Table 1  Precision evaluation for detection of hsa_circ_
                    细胞周期检测：取转染 48 h 后的细胞，按试剂                               0001479 and 18s rRNA via RT⁃qPCR  （%）
                盒说明书操作后通过流式细胞仪检测。                                       指标           hsa_circ_0001479  18s rRNA
                    细胞迁移和侵袭能力检测：①细胞划痕实验：                            cDNA（高浓度）
                细胞转染48 h后，在各孔中央用100 μL枪头十字划                           批内CV                0.95           0.45
                线，用 PBS 洗涤后加入培养基，放入培养箱，分别在                            批间CV                2.77           2.31
                                                                    cDNA（低浓度）
                培养的第0 h、12 h及24 h在显微镜下拍照。②Tran⁃
                                                                      批内CV                1.65           0.88
                swell 实验：取转染 48 h 后的细胞，以 50 000 个/室接
                                                                      批间CV                4.17           3.42
                种于Transwell 小室的上室中（侵袭实验需预先铺一
                                                                      CV：变异系数。
                层 Matrigel 胶），在下室（24 孔扳）中加入 600 μL 含
                20％胎牛血清的完培，培养 48 h 后取出，经 PBS 洗                    2.2  Hsa_circ_0001479成环性和稳定性验证
                涤，甲醛固定30 min，结晶紫染色15 min，PBS洗涤、                       Hsa_circ_0001479 的分子结构示意图来源于
                晾干后在显微镜下拍照并计数。                                    CSCD数据库（图3A）。其环化位点的位置见测序结
                1.3  统计学方法                                        果图上的箭头标示（图 3B）。通过 RT⁃qPCR 检测发
                    用GraphPad Prism 7和SPSS 20.0软件分析实验             现，RNase R 处理后 hsa_circ_0001479 的来源基因
                数据并绘制统计图。采用t检验分析两组数据的组                            ZNF131 的 mRNA 表达水平显著下降，而 hsa_circ_
                间差异性；采用卡方检验分析 hsa_circ_0001479 表                  0001479 的表达水平仅略有下降（图 3C），说明 hsa_
                达水平与临床病理参数的关系；采用单因素方差分                            circ_0001479具有较好的稳定性。此外，以cDNA和
                析（one⁃way ANOVA）分析多组数据的组间差异性；                     gDNA 为模板扩增 hsa_circ_0001479 和 ZNF131，琼
                P < 0.05为差异有统计学意义。                                脂糖凝胶电泳结果显示，ZNF131 可以在 cDNA 和
                                                                  gDNA 中被扩增，而 hsa_circ_0001479 只能在 cDNA
                2  结 果
                                                                  中 被 扩 增（图 3D）。 以 上 实 验 证 明 了 hsa_circ_
                2.1  RT⁃qPCR检测hsa_circ_0001479的方法学性能              0001479为结构稳定的闭合环状RNA。
                评价                                                2.3  Hsa_circ_0001479在胃癌组织中的表达及其与
                    精密度评价：连续5 d通过RT⁃qPCR检测2份不                     临床病理参数的关系
                同浓度的 cDNA 标本，结果发现 RT⁃qPCR 检测目的                        RT⁃qPCR 结果显示，hsa_circ_0001479 在胃癌
                分子hsa_circ_0001479和内参分子18s rRNA均有良                组织中的表达水平显著高于癌旁组织（P < 0.000 1，
                好的批内和批间精密度（表1）。                                   图 4）。 结 合 患 者 的 病 理 资 料 ，分 析 hsa_circ_
                    正确度评价：采用 RT⁃qPCR 检测胃癌组织中                      0001479表达水平与各临床病理参数之间的关系，χ                    2
                hsa_circ_0001479的表达，发现目的分子和内参分子                   检验分析结果显示，hsa_circ_0001479 表达水平与
                熔解曲线呈单峰，说明扩增产物的特异性良好（图                            肿瘤大小（P=0.039）、浸润深度（P=0.044）、淋巴结转
                1A）。将扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果发现目                          移（P=0.011）、TNM 分期（P=0.021）和 CA19⁃9（P=
                的分子和内参分子的条带单一，片段大小与预期相符                           0.042）有关（表2）；以上结果提示胃癌组织中高表达
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