Page 36 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第5期
·618 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2023年5月
胃癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,是全球 吉玛制药技术有限公司);空载体、hsa_circ_0001479
第四大癌症死亡原因,仅次于肺癌、结直肠癌和肝 pcDNA(广州吉赛生物科技有限公司);CCK⁃8 试剂
癌 。尽管近年来胃癌发病率有所下降,但由于缺 盒(Dojindo 公司,日本);Transwell 小室(BD 公司,
[1]
乏有效的早期诊断指标,胃癌患者的治疗效果不 美国);细胞周期检测试剂盒(北京索莱宝科技有
佳,预后差,死亡率较高 [2-3] 。目前,手术治疗是胃癌 限公司)。
唯一的根治性治疗方法,放化疗或其他治疗方法常 1.2 方法
作为辅助治疗手段与手术结合使用 [4-5] 。因此,对胃 1.2.1 RT⁃qPCR
癌发生发展的分子机制进行更广泛和深入的研究对 根据说明书使用TRIzol试剂从胃癌及癌旁组织
寻找新的诊断指标和治疗靶点,改善胃癌患者预后, 或细胞中提取总 RNA。用分光光度计测定每个
提高存活率有重要意义。环状 RNA(circular RNA, RNA 样本的浓度。参照说明书用逆转录试剂盒将
circRNA)是一类具有闭合环状结构且多不具有蛋 总 RNA 反转录成互补 DNA(cDNA),反应条件为
白编码能力的 RNA 。由于具有稳定的环状结构, 25 ℃ 5 min,42 ℃ 1 h,70 ℃ 5 min,4 ℃保存。在
[6]
不易降解,且表达具有组织和疾病特异性,CircRNA Light Cycler 480 PCR 仪(Roche 公司,美国)上使用
[7]
有望成为新型肿瘤标志物和治疗靶点的潜力 。为 SYBR Green Ⅰ mix 通过 RT⁃qPCR 检测 circRNA 的
探寻新的胃癌差异circRNA,本文结合文献circRNA 表达量,反应条件为 95 ℃ 10 min,95 ℃ 15 s,60 ℃
[8]
芯片结果 并经实时荧光定量PCR(RT⁃qPCR)初步 30 s,72 ℃ 30 s,共 45 个循环。以 18s rRNA 作为内
验证发现 hsa_circ_0001479 可能在胃癌组织中高表 参,hsa_circ_0001479 的引物序列为 F:5′⁃ATCTTC⁃
达,因此选择该分子进行更深入的研究。本研究 GAAAACATACAGAGCAGC⁃ 3′和 R:5′⁃AACTCCT⁃
首次验证了 hsa_circ_0001479 在胃癌组织中表达 GAAGGCATTCCATC⁃3′;18s rRNA的引物序列为F:
增高并探究了其对胃癌细胞增殖、侵袭和迁移能 5′⁃GTAACCCGTTGAACCCCATT⁃3′和 R:5′⁃CCATC⁃
力的影响,从而初步阐明其在胃癌发生发展中的 CAATCGGTAGTAGCG⁃3′;ZNF131 的引物为 F:5′⁃
作用。 ACACGTGTGCAAACTGAACC ⁃ 3′ 和 R:5′ ⁃ CCTG⁃
GAGCAGATCTGGATGG⁃3′。用 2 -ΔΔCt 法对目的分子
1 材料和方法
和内参分子进行相对定量分析。
1.1 材料 1.2.2 RT⁃qPCR方法学性能评价实验
收集2017年6月—2020年7月在南通大学附属 精密度评价:依据 EP15⁃A2 文件制定的定量检
医院手术的胃癌及配对远端癌旁组织76例(男57例, 测方法精密度性能评价标准,选用6 μg组织RNA和
女 19 例),年龄 37~82 岁。组织标本一经取出立即 3 μg细胞RNA逆转录得到的高低2个浓度的cDNA
置于-80 ℃冰箱保存。所有标本均在放化疗前采 作为实验样本,每天检测1个批次,2份样本,每份样
集,并经病理确诊。本研究经南通大学附属医院伦 本重复测定4次,连续检测5 d。
理委员会批准。4 株胃癌细胞株(MGC⁃803、SGC⁃ 正确度评价:收集目的分子的 RT⁃qPCR 产物
7901、MKN⁃45 和 BGC⁃823)及 1 株正常胃黏膜上皮 50 μL 并送测序公司进行测序,得到的测序结果与
细胞株(GES⁃1)均购自中国科学院上海生命科学研 Circbase 数据库提供的分子序列进行比对,观察碱
究细胞资源库。 基顺序是否一致,扩增片段中是否包含环化位点;将
本研究使用的试剂为TRIzol(Invitrogen公司,美 目的分子与内参分子的RT⁃qPCR产物进行琼脂糖凝
国);逆转录试剂盒(Thermo 公司,美国);DEPC 水、 胶电泳,观察产物片段大小与预期是否一致。
18s rRNA 引物和 ZNF131 引物(上海生工生物工程 线性范围评价:将细胞RNA逆转录得到的cDNA
股份有限公司);hsa_circ_0001479 引物(广州锐博 以 10 倍倍比稀释,设立 5~7 个浓度梯度,通过 RT⁃
生物科技有限公司);SYBR GreenⅠmix(北京百泰 qPCR 检测线性范围,用 GraphPad Prism 7 软件进行
克生物技术有限公司);核糖核酸酶 R(Rnase R) 线性回归分析并作图。
(Epicentre 公司,美国);RPMI 1640 培养基和 Matri⁃ 1.2.3 转染与细胞增殖、迁移和侵袭能力检测
gel 胶(Corning 公司,美国);Lonsera 特级胎牛血清 转染:将MKN⁃45、BGC⁃823和SGC⁃7901细胞株
(上海双洳生物科技有限公司);siNC、hsa_circ_ 分别培养于 6 孔板中,分为对照组和干扰或过表达
0001479 siRNA 和 GP⁃transfect⁃Mate 转染试剂(上海 组 ,使 用 GP ⁃ transfect ⁃ Mate 转 染 试 剂 将 siNC 和