Page 75 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 75

第43卷第5期      顾圣玮，顾     浩，马晴晴，等. 蛋白酶激活受体2经RhoA信号抑制人内皮祖细胞增殖、迁移功能［J］.
                  2023年5月                     南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（5）：655-662                        ·657 ·


                receptor⁃2，VEGFR⁃2）、SDF⁃1、趋化性细胞因子受体
                                                                  2  结 果
                4（C⁃X⁃C chemokine receptor type 4，CXCR⁃4）mRNA
                表达量。100 pmol/L Tr或100 μmol/L SLIGKV⁃NH2 刺         2.1 类胰蛋白酶、SLIGKV⁃NH2抑制EPC增殖与迁移
                激 EPC 24 h，PBS 清洗 2 遍，使用 TRIzol 提取细胞总                 Tr 是 PAR2 的天然激动剂。免疫印迹结果显
                RNA，逆转录试剂盒逆转录后加入 SYBR 进行实时                        示，EPC存在PAR2表达，给予Tr100 pmol/L处理24 h
                定量PCR实验。扩增条件为下：预变性95 ℃30 s →                      后，PAR2表达上调（P < 0.05），PAR2抑制剂FS可取
                变性95 ℃ 5 s → 退火60 ℃ 30 s → 延伸72 ℃ 10 min，         消此效应（图 1A），提示类胰蛋白酶可通过 PAR2 引

                共 40 个循环。以 GAPDH 为内参，计算 2            -∆∆CT 值，最    起自身反馈性表达增高。细胞增殖、迁移是血管生
                后比较目的基因相对表达量。所用引物委托南京                             成的重要事件。本研究结果显示，不同浓度（1、10、
                金斯瑞生物科技有限公司合成：人 GAPDH 上游引                         50、100、1 000 pmol/L）Tr处理24 h可导致细胞增殖、

                物5′⁃AGAAGGCTGGGGCTCATTTG⁃3′，下游引物5′⁃               迁移功能明显减弱（P < 0.05，图1B、C）。AP作为激
                AGGGGCCATCCACAGTCTTC⁃3′；人VEGF⁃A上游引                活 PAR2 的模拟合成肽，亦可剂量依赖性（1、10、
                物 5′⁃AGGGCAGAATCATCACGAAGT⁃3′，下游引物                50、100、200 μmol/L）抑 制 EPC 增 殖 与 迁 移（P <
                5′⁃AGGGTCTCGATTGGATGGCA⁃3′；人 VEGFR⁃2 上            0.05，图1D、E），浓度≥100 μmol/L 时差异具有显著
                游引物 5′⁃GGCCCAATAATCAGAGTGGCA⁃3′，下游                性。据上述结果，后续实验选择 100 pmol/L Tr 和

                引物5′⁃CCAGTGTCATTTCCGATCACTTT⁃3′；人SDF⁃1            100 μmol/L AP进行。
                上游引物 5′⁃ATTCTCAACACTCCAAACTGTGC⁃3′，               2.2  PAR2 激活下调 EPC 增殖、迁移相关细胞因子
                下游引物 5′⁃ACTTTAGCTTCGGGTCAATGC⁃3′；人                及受体表达
                CXCR ⁃ 4 上 游 引 物 5′ ⁃ ACTACACCGAGGAAAT⁃               EPC 释放的生长、趋化因子及其受体参与缺血
                GGGCT⁃ 3′，下游引物 5′⁃CCCACAATGCCAGTTA⁃               组织处细胞的增殖与迁移。实时定量 PCR 结果显
                AGAAGA⁃3′。                                        示，Tr、SLIGKV⁃NH2下调VEGF⁃A、VEGFR⁃2、SDF⁃1、
                1.2.5 ELISA                                       CXCR⁃4 的 mRNA 水平（P < 0.05，图 2A）。ELISA 结
                    ELISA 检测 EPC 上清中 VEGF⁃A 及 SDF⁃1 的蛋            果亦显示，PAR2激活后EPC上清中VEGF⁃A及SDF⁃1
                白表达量。100 pmol/L 类胰蛋白酶或 100 μmol/L                 的蛋白表达量显著下降（P < 0.05，图2B）。
                SLIGKV⁃NH2刺激EPCs 24 h后收集细胞上清，采用                   2.3  PAR2抑制剂FS取消PAR2活化引起的EPC功
                人 VEGF⁃A、SDF⁃1 ELISA 检测试剂盒，根据说明书                  能改变
                进行检测。                                                 为了探讨PAR2激动剂引起的EPC功能改变是
                1.2.6 蛋白质免疫印迹实验                                   否直接经由PAR2受体实现，本研究选用PAR2抑制
                    蛋白质免疫印迹实验检测 EPC 中 PAR2、RhoA                   剂 FS 以阻断 PAR2 受体功能。200 μmol/L FS 可取
                蛋白水平。不同药物作用 EPC 24 h 后收集细胞，                       消 2 种激动剂诱导的 EPC 细胞增殖、迁移功能下调
                200 μL RIPA 冰 上 裂 解 15 min ；收 集 裂 解 物 ，           效应（P < 0.05，图3）。
                12 000 r/min 离心 20 min 后吸取上清，十二烷基                 2.4  RhoA参与介导PAR2活化引起的EPC增殖、迁
                硫酸钠蛋白变性；制胶上样，80~120 V 恒压电泳，                       移抑制过程
                300 mA 恒流 PVDF 转膜；含 Tween 20 的 Tris 洗涤缓               作为 PAR2 下游的重要信号分子，RhoA 参与
                冲液（tris buffered saline tween，TBST）配制 5%脱脂        调节细胞的骨架重塑、黏附运动等功能。免疫印
                奶粉溶液，室温封闭 1 h；加入抗 PAR2（1∶1 000）、                  迹结果显示，Tr、AP 处理 EPC 24 h 后，RhoA 表达
                RhoA（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）抗体 4 ℃孵育过             显著上调（P < 0.05），PAR2 抑制剂 FS 可取消此上
                夜；TBST 洗涤后，与辣根过氧化物酶标记的山羊抗                         调效应（图 4A）。同时，予以特异性 RhoA 抑制剂

                兔 IgG 抗体孵育；ECL 化学发光液曝光，并用 Bio⁃                    Y⁃27632（图 4B，C），PAR2 激动剂引起的 EPC 增
                Rad成像系统及Image J软件进行分析。                            殖、迁移抑制被逆转（P < 0.05）。

                1.3  统计学方法
                                                                  3 讨 论
                    应用 Graphpad 6.0 进行分析处理，计量资料以
                均数±标准误（x ± Sx ）表示，单因素方差分析比较多                          本研究通过分离、培养人外周血来源的EPC，发
                组间差异。P < 0.05为差异有统计学意义。                           现选择性激活 PAR2 可经由 RhoA 信号抑制 EPC 增
   70   71   72   73   74   75   76   77   78   79   80