Page 74 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 74

第43卷第5期
               ·656 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年5月


                  蛋白酶激活受体（protease⁃activated receptor，          linked immuno sorbent assay，ELISA）检 测 试 剂 盒
              PAR）属 G 蛋白偶联受体，包括 4 个亚型。其中，                       （DVE00，R&D 公司，美国），人基质细胞衍生因子 1
              PAR2作为唯一胰酶受体，功能最为特殊，可被胰蛋                          （stromal cell⁃derived factor⁃1，SDF⁃1）ELISA 检测试
              白酶、类胰蛋白酶等活化，在平滑肌、上皮和内皮等                           剂盒（DSA00，R&D 公司，美国）；抗 PAR2 特异性抗
                                      ［1］
              多种结构细胞上均有表达 。研究表明，多种血管                            体（ab180953，Abcam公司，英国），抗RhoA特异性抗
              疾病进展与PAR2的激活有关，如肺动脉高压、动脉                          体（ab187027，Abcam公司，英国），抗甘油醛⁃3⁃磷酸
              粥样硬化、糖尿病血管并发症等，提示 PAR2 在调                         脱氢酶（glyceraldehyde⁃3⁃phosphate dehydrogenase，
              节内皮完整性和血管稳态方面起重要作用                     ［2-3］ 。有   GAPDH）特异性抗体（2118，CST 公司，美国），辣根
              研究显示，PAR2活化可参与内皮细胞的多种功能，                          过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG抗体（sc⁃2004，San⁃
              如细胞增殖、血管生成及促炎介质释放等                    ［4-5］ 。Ras  ta Cruz 公 司 ，美 国）；EGM ⁃ 2 BulletKit 培 养 基
              同 源 家 族 成 员 A（Ras homolog family member A，        （CC3162，Lonza公司，美国）。
              RhoA）作为重要的 PAR2 下游信号 ，被证实参与                            本研究方案经南京医科大学第一附属医院伦
                                              ［6］
              内皮功能调控       ［7-8］ 。在研究中发现作为调节内皮完                 理委员会批准（伦理号：2019⁃SR⁃184），并获得所有

              整性和血管稳态的重要来源，内皮祖细胞（endo⁃                          患者的书面知情同意书。
              thelial progenitor cell，EPC）存在 PAR2 表达，然其         1.2  方法
              是否参与调控 EPC 功能及其相关机制目前仍知                           1.2.1 细胞培养
              之甚少。                                                   人外周血分离EPC，培养于EGM⁃2完全培养基
                  EPC 起源于骨髓，可从外周血单个核细胞中分                        中，置 37 ℃、5% CO2条件的细胞培养箱孵育，每隔
                     ［9］
              离提取 ，体内外均具有高增殖和促血管生成潜                             2~3 d 更换培养基，直至细胞密度达 80%后，胰酶消
              能。机体受损时，损伤部位释放趋化细胞因子可使                            化、传代。选择第4~6代细胞进行实验。
              EPC 从骨髓动员至外周血，继而迁至受损处分化为                          1.2.2 EdU掺入实验
              成熟内皮细胞，嵌入并修复血管               ［10］ 。有证据证实，              EdU掺入实验检测 EPC 增殖功能。细胞铺至
              肺动脉高压患者循环EPC数量显著减少并伴功能障                           孔板并饥饿 6~8 h 后，以不同浓度类胰蛋白酶、
                                                      ［11］
              碍，提示EPC可能是血管功能异常的重要原因 。近                          SLIGKV⁃NH2 分别刺激 EPC 24 h，抑制剂联合组在
              年来在一些血管相关疾病如肺动脉高压                   ［12］ 、糖尿病     PAR2 激动剂给药前 30 min 予 FS 或 Y⁃27632；50
              血管并发症     ［13］ 和冠心病  ［14］ 中，EPC 作为细胞治疗的           μmol/L EdU 孵 育 4 h 后 ，固 定 、破 膜 、Apollo 及
              有力候选成员之一，其功能改善已成为治疗此类疾                            Hoechst 染 色 。 通 过 计 算 Apollo、Hoechst 双 染 的
              病的重要策略。                                           细胞核数目以评估细胞增殖率。随机选取 5 个
                  EPC 表达 PAR2，而 PAR2 激活能否调节 EPC 功               不同视野进行拍照计数，重复 3 次后进行统计
              能有待进一步研究。本研究通过体外培养 EPC，观                          学分析。
              察 PAR2 活化对 EPC 增殖、迁移功能的影响及其相                      1.2.3 Transwell小室实验
              关因子、受体的水平变化，阐明RhoA信号在该过程                               Transwell 小室实验检测 EPC 迁移功能。细胞
              中的重要作用。                                           铺板并饥饿 6~8 h，低血清培养基调整细胞密度后
                                                                以 150 μL 细胞悬液接种于 Transwell 上室，置于 24
              1  材料和方法
                                                                孔板中，加入含不同刺激物的完全培养基于下
              1.1  材料                                           室；细胞培养箱孵育 24 h，弃培养基、PBS 清洗，
                  类胰蛋白酶（Tr，T7063，Sigma⁃Aldrich 公司，美             多聚甲醛固定 30 min 后棉签擦拭移除小室上层
              国）；PAR2激动剂SLIGKV⁃NH2（AP，RP20334，南京                细胞，结晶紫染色后 PBS 清洗、晾干，显微镜拍
              金 斯 瑞 公 司），PAR2 抑 制 剂 FSLLRY ⁃ NH2（FS，            照。随机选取 4 个不同视野进行拍照计数并统

              C7865BL120⁃1，南京金斯瑞公司），RhoA 抑制剂 Y⁃                 计学分析。
              27632（B1293，Apexbio公司，美国）；EdU细胞增殖检                1.2.4 实时定量PCR
              测试剂盒（C10310，广州锐博生物科技有限公司），                             实时定量 PCR（real⁃time quantitative polymerase

              人血管内皮生长因子 A（vascular endothelial growth           chain reaction，qPCR）检测 EPC 中 VEGF⁃A、血管内
              factor⁃A ，VEGF⁃A）酶 联 免 疫 吸 附 实 验（enzyme⁃          皮生长因子受体 2（vascular endothelial growth factor
   69   70   71   72   73   74   75   76   77   78   79