Page 32 - 南京医科大学学报自然科学版
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第43卷第6期
               ·774 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年6月


              wiper）（南京诺唯赞公司），转染试剂 GenEscort             TM  I  发光液进行检测。
             （南京慧基生物公司），线粒体超氧化物（mitochon⁃                       1.2.5 qRT⁃PCR
              drial superoxide，mitoSOX）指示剂溴化乙锭衍生物、                   试剂盒提取 Drp1 敲低和其对照稳转系、以及
              线 粒 体 膜 电 位（mitochondrial membrane potential，     DMSO和Mdivi⁃1分别处理的MEF细胞的RNA，将其
              MMP）指示剂四甲基罗丹明甲酯（Invitrogen Life Sci⁃              逆转录为 cDNA，稀释 10 倍后待用。将 SYBR Green
              ence公司，美国）。                                       10 μL，cDNA 4 μL，上、下游引物（母液10 μmol/L）各
              1.2  方法                                           0.2 μL（表1），ddH2O 5.6 μL混合进行qRT⁃PCR实验。
              1.2.1 细胞培养
                                                                            表1   实时定量PCR相关引物
                  MEF 和 HEK293T 细胞均培养于含有 10％胎牛
                                                                  Table 1  Relative primers of real⁃time quantitative PCR
              血清和1％青霉素⁃链霉素的DMEM完全培养基，置
                                                                     基因                  引物（5′→3′）
              于37 ℃、5％CO2的培养箱孵育。
                                                                   ABCB10        上游GCCGTCTCCTCTCGGATATG
              1.2.2 慢病毒沉默体系构建敲低稳转细胞系
                                                                                 下游CTGGCGAACAGGGGATGTG
                  病毒包装：待 10 cm 细胞培养皿中的 HEK293T                     GAPDH         上游TGGCCTTCCGTGTTCCTAC
              细 胞 融 合 度 大 致 为 50％ 时 更 换 细 胞 培 养 液 。                              下游GAGTTGCTGTTGAAGTCGCA
              pLKO.1⁃shDrp1/pLKO.1⁃shABCB10/pLKO.1 5.0 μg、

              pMDL g/p RRE 2.5 μg、pRSV⁃Rev 1.25 μg、pCMV⁃        1.2.6  乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase，LDH）细
              VSVG 1.5 μg与20 μL转染试剂于200 μL不含血清与                 胞毒性检测
              抗生素的DMEM中混合均匀，室温孵育15 min后加入                            待96孔板中细胞融合度大致为80％时，多孔板
              HEK293T细胞中摇匀。24 h后弃旧培液，加入10 mL                    离心机400 g离心5 min，取上清120 μL到新的96孔
              完全培养基，48 h 后再次加入 10 mL 完全培养基。                     板中。加入60 μL LDH工作液，混匀，室温避光孵育
              72 h 后将 20 mL 培养液用 0.45 μm 滤膜过滤细胞碎                30 min，490 nm测定吸光度值。
              片后，加入 5 mL 5×PEG8000 于 4 ℃混悬过夜浓缩                  1.2.7 线粒体活性氧和MMP检测
              病毒，次日 4 ℃ 12 000 r/min 离心 30 min，PBS 混悬                待 6 孔板细胞融合度大致为 80％时，弃掉培养
              沉淀分装。                                             液 ，PBS 清 洗 1 遍 ，胰 酶 消 化 后 用 培 养 液 终 止 。
                  病毒感染以及稳转系筛选：6 孔板 MEF 细胞融                      3 000 r/min 离心 3 min，PBS 清洗后再次离心。每组
              合度为 50％时加入病毒和聚凝胺（10 μg/mL）感染                      按照染料母液与培养液1∶1 000的比例加入200 μL
              48 h 后，加入含 2 μg/mL 嘌呤霉素的 DMEM 完全培                 染料，混匀，37 ℃孵育 30 min。PBS 清洗 3 次，混悬
              养基筛选至未感染细胞全部死亡后进行正常传代。                            后通过流式细胞仪检测。
              1.2.3 药物及小分子多肽处理                                  1.3  统计学方法
                  不同浓度（0、2.5、5.0、10.0 mmol/L）3⁃NP 处理                 以 上 实 验 结 果 分 析 均 采 用 GraphPad Prism
              Drp1⁃KO、Drp1 敲低（sh⁃Drp1）以及对照细胞 24 h。              8.3.0。两组间比较使用student’s t test，单因素多组
              1 μmol/L 的小分子多肽 TAT 和 P110 分别加入 MEF               间比较使用 one⁃way ANOVA，双因素多组间比较使
              细胞处理 24 h。40 nmol/L 的 DMSO 和 Drp1 抑制剂             用two⁃way ANOVA 。所有数据均以均数±标准差（x
              Mdivi⁃1分别加入MEF细胞处理16 h。                           ± s）表示。P＜0.05为差异有统计学意义。
              1.2.4 Western blot实验
                                                                2  结 果
                  提取处理后的细胞总蛋白，加入蛋白酶抑制剂
              后进行蛋白定量，取 30 μg 蛋白进行 Western blot 实               2.1  敲除或敲低Drp1可激活mtUPR

              验。用制备好的5％浓缩胶和10％分离胶进行80 V                              不同浓度（0、2.5、5.0、10.0 mmol/L）3⁃NP 处理
              恒压电泳15 min后，调电压至160 V；待蛋白分子分                      WT 组、Drp1⁃KO、pLKO 组和 sh⁃Drp1 组细胞 24 h。

              离，360 mA恒流100 min电转，5％脱脂牛奶封闭NC                    Western blot 结果显示，与对照相比，mtUPR 激活的
              膜 1 h。一抗（CHOP 1：1000，ABCB10 1∶500，Drp1            转录因子 CHOP 的蛋白表达水平显著上升（P＜
              1∶1 000，LONP1 1∶1 000，Hsp60 1∶1 000）4 ℃孵育         0.05，图 1），Drp1⁃KO 和 sh⁃Drp1 分别与 WT 和 pLKO
              过夜，TBST洗膜10 min×3，二抗（HRP标记1∶5 000）                各浓度对照组相比，CHOP蛋白的表达水平上升（图
              2 h，TBST 洗膜 10 min×3。SageBrightness ECL 化学        1）。提示Drp1表达水平下降可显著增强3⁃NP诱导
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