Page 46 - 南京医科大学学报自然科学版
P. 46

第43卷第6期
               ·788 ·                            南 京    医 科 大 学 学         报                        2023年6月


              碘化丙啶（Annexin V⁃FITC/PI）细胞凋亡检测试剂盒                  1.2.2 神经功能缺损评分
             （货号分别为P0013B、P0012S、C00038、C1062S，上海                    在手术清醒后（给药前）和给药结束后，参照
              碧云天生物科技公司）；乳酸脱氢酶（lactate dehydro⁃                 Longa 评分法对大鼠进行神经功能缺损评分。评分
              genase，LDH）试剂盒（微板法，A020⁃2⁃2，南京建成生                 标准：0 分，无明显神经功能缺损；1 分，提尾时不能
              物工程研究所）；兔源一抗 PKC（ab181558）、p⁃PKC                  完全伸展对侧前肢；2 分，行走时向对侧旋转；3 分，
             （ab109539）、ERK1/2 （ab184699）、p⁃ERK1/2 （ab201015）、  行走时向对侧倾斜；4分，不能自主活动或伴意识障
              Bcl ⁃ 2（ab194583）、Bax（ab32503）、Caspase ⁃ 3        碍。分数越高表示神经功能缺损越严重。
             （ab184787）、GAPDH（ab181602）、NeuN 抗 体                1.2.3 HE染色观察脑组织海马区病理学变化
             （ab177487），二 抗 山 羊 抗 兔 IgG H&L（HRP）                     行为学检测完成后，麻醉大鼠，断头取脑，冠状切
             （ab205718）、山羊抗兔 IgG H&L（Alexa Fluor 488，           分为两部分，一部分-80 ℃冰箱保存，用于 Western
                                                      ®
              绿色荧光）（ab150077）（Abcam 公司，英国）。BX61                 blot实验，另一部分4%多聚甲醛固定，石蜡包埋、切
              电子显微镜（Olympus 公司，日本），TCS SP2 共聚焦                  片，进行HE染色，观察脑组织海马区病理学变化。
              显微镜（Leica 公司，德国），FACScan 流式细胞仪                    1.2.4 TUNEL/NeuN荧光双染观察海马神经元凋亡
             （BD Biosciences公司，美国）。                                  取石蜡切片，脱蜡并与 0.1% Triton X⁃100 在室

              1.2  方法                                           温下孵育 8 min。柠檬酸/柠檬酸钠溶液 95 ℃修复
              1.2.1 HIE大鼠模型的构建与分组                               10 min 后，将组织用 TUNEL 溶液 37 ℃孵育 60 min，
                  从 90 只新生大鼠中随机选取 12 只为假手术                      然后用NeuN 抗体（1∶300）4 ℃过夜。样品用PBS洗
              组，3%的异氟烷麻醉后手术过程中以 2%的剂量维                          涤 3 次，并与 Alexa Fluor 488 标记的山羊抗兔 IgG
                                                                                      ®
              持麻醉。除假手术组外，其余大鼠采用结扎右颈总                            （1∶200）室温下孵育60 min，DAPI染核，用抗荧光淬
              动脉和低氧处理2.5 h的方法构建HIE模型                ［11］ ：将大    灭剂密封组织，并使用荧光显微镜观察、拍照；计数
              鼠仰卧固定以暴露颈前区，在颈部中线行一个小切                            每个视野下NeuN TUNEL 阳性细胞数，每个切片随
                                                                                       +
                                                                                +
              口，将右颈总动脉与周围组织分离，并使用 5⁃0 外                         机选择3个视野进行计数并取平均值。
              科丝线缝合双结扎，在两个结扎之间切断动脉；缝                            1.2.5  Western blot 检测脑组织 PKC/ERK 通路及凋
                                                                亡相关蛋白的表达
              合切口，让幼崽恢复 1 h，然后置于缺氧环境（8% O2
              和 92% N2 ）的锥形瓶中，并将其浸入 37 ℃水浴中                          用RIPA裂解液提取脑组织/海马神经元细胞裂
              2.5 h；然后，将所有幼崽放回各自的母鼠笼中。假                         解物，14 000 g 4 ℃离心 30 min。收集并等分上清
              手术组幼崽经过麻醉和右颈总动脉暴露，没有结扎                            液，随后通过BCA测定法测量蛋白质浓度。将等量
              和缺氧。若大鼠出现站立不稳、右侧肢体瘫痪、提                            的蛋白质（30 μg）加到SDS⁃PAGE凝胶上进行电泳，
              尾时不能伸展对侧前肢等现象，表明 HIE 模型构建                         并将其转移到PVDF膜上，然后用5%脱脂牛奶封闭
              成功。实验过程中，有 15 只大鼠死亡，存活且造模                         1 h，与一抗（PKC、p⁃PKC、ERK1/2、p⁃ERK1/2、Bcl⁃2、
              成功的大鼠共63只。因为新生大鼠各器官发育并不                           Bax、Caspase⁃3、GAPDH，1∶1 000）4 ℃下孵育过
              完善，造模时死亡数量会较多，其中造模死亡率为                            夜。第2天，将膜与二抗（HRP标记的山羊抗兔IgG，
              19.23%，模型成功率为80.77%，在可接受的范围。                      1∶2 000）室温下孵育 1 h。ECL Plus 化学发光试剂
                  取60只造模成功大鼠，随机分为模型组、白屈菜                        显色，Image⁃Pro Plus 6.0软件进行灰度分析。
              红碱组（5 mg/kg） 、败酱总黄酮低剂量组（50 mg/kg）、                1.2.6 原代海马神经元的分离
                            ［12］
                                            ［8-10］
              败酱总黄酮高剂量组（100 mg/kg）             、败酱总黄酮+               在胚胎第18天从SD大鼠胚胎中分离海马神经
              白屈菜红碱组（100 mg/kg 败酱总黄酮+5 mg/kg 白屈                 元，用于初级神经元分离。切除、解剖海马组织，小
              菜红碱），每组12只。白屈菜红碱组大鼠腹腔注射                           心取出附着的脑膜。然后用 PBS 冲洗海马。用木
              白屈菜红碱 5 mg/kg，败酱总黄酮各剂量组灌胃相                        瓜蛋白酶（0.5 U/g）和脱氧核糖核酸酶 I（DNase I）
              应剂量的败酱总黄酮，败酱总黄酮+白屈菜红碱组                            的混合物消化海马体，32 ℃下保持 12 min。消化
              大鼠在灌胃 100 mg/kg 败酱总黄酮的同时腹腔注射                      后，细胞过滤器（40 μm）过滤以去除细胞碎片。然
              5 mg/kg 白屈菜红碱，假手术组和模型组大鼠给予                        后以180 g离心10 min，弃去上清液并以3×10 个/mL
                                                                                                        4
              等量的生理盐水灌胃和腹腔注射，1 次/d，连续给                          的细胞密度重悬沉淀。随后将细胞接种在 12 孔板
              药 7 d。                                            上。大鼠胚胎海马神经元在37 ℃、5% CO2下培养于
   41   42   43   44   45   46   47   48   49   50   51