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第43卷第6期      扎西吉，张    赟，马凤美，等. 基于PKC/ERK通路探讨败酱总黄酮对缺氧缺血性脑病新生大鼠神经元
                  2023年6月               凋亡的影响［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2023，43（6）：786-794                    ·789 ·


                含有 2% B27 补充剂和 0.5 mmol/L L⁃谷氨酰胺的                 细胞凋亡率。
                Neurobasal培养基中。                                   1.3  统计学方法
                1.2.7  CCK⁃8法评估败酱总黄酮对原代海马神经元                          采用GraphPad Prism 8.0软件对数据进行分析，
                及氧⁃葡萄糖剥夺/再灌注（oxygen⁃glucose depriva⁃              结果以均值±标准差（x ± s）表示。多组间比较采用
                tion/reperfusion，OGD/R）后原代海马神经元细胞活                单因素方差分析，组间两两比较采用 SNK⁃q 检验。
                力的影响                                              P＜0.05为差异有统计学意义。
                    将海马神经元细胞以1 000个/孔的密度接种到
                                                                  2  结 果
                96 孔板中，用含不同终浓度0、5、10、20、40、80 μmol/L
                败酱总黄酮的培养基处理原代海马神经元细胞                              2.1  各组大鼠的神经行为学评估
                24 h。然后向孔中加入 10 μL CCK⁃8 工作液并在                        造模前，所有大鼠的神经功能均正常。造模成
                37°C下孵育2 h。最后在450 nm波长下评估各孔的                      功后，与假手术组相比，模型组大鼠出现不同程度
                吸光度值，计算细胞活力。                                      的神经功能缺损现象，如活动减少、提尾时左侧前
                    将海马神经元细胞以1 000个/孔的密度接种到                       爪不能完全伸展、行走时向一侧转圈等，神经功能
                96 孔板中，除对照组外，其余各组将神经元培养基                          缺损评分显著增加（P＜0.05）。给药结束后，与模型
                替换为不含葡萄糖的 DMEM 培养基，在 37 ℃缺氧                       组相比，败酱总黄酮低、高剂量组神经功能改善，神
               （95% N2和 5% CO2 ）室中培养 4 h 以建立 OGD/R 模              经功能缺损评分显著降低（P＜0.05），而白屈菜红碱
                型。之后在常氧条件下（5% CO2和95%空气、37 ℃）                     组神经功能缺损评分显著升高（P＜0.05）；与白屈菜
                对细胞进行再氧化 ，并在神经元培养基中培养                             红碱组相比，败酱总黄酮+白屈菜红碱组神经功能
                24 h。对照组细胞在常氧条件下用神经元培养基                           缺损评分显著降低（P＜0.05）；与败酱总黄酮高剂量
                培养，OGD/R 组中的细胞暴露于 OGD/R 环境中，                      组相比，败酱总黄酮低剂量组和败酱总黄酮+白屈菜
                败酱总黄酮处理组用含不同终浓度（0、5、10、20、                        红碱组神经功能缺损评分显著升高（P＜0.05，表1）。
                40、80 μmol/L）的败酱总黄酮培养基处理原代海马
                                                                      表1  各组大鼠神经功能缺损评分和翻正反射时间
                神经元细胞24 h。
                                                                  Table 1  Neurological deficit score and righting reflex
                1.2.8 OGD/R细胞模型建立                                          time of rats in each group  （分，x ± s，n=12）
                    将海马神经元细胞分为对照组、OGD/R 组、败
                                                                                              神经功能缺损评分
                酱总黄酮组（20 μmol/L）、败酱总黄酮（20 μmol/L）+白                         组别              给药前         给药后
                屈菜红碱（10 mmol/L）组。OGD/R诱导方法同1.2.7，                  假手术组                       0           0
                对照组细胞在常氧条件下用神经元培养基培养。                              模型组                    2.41 ± 0.25 *  2.34 ± 0.26 *
                OGD/R 组中的细胞暴露于 OGD/R 环境中。败酱总                       白屈菜红碱组                 2.38 ± 0.26 *  2.95 ± 0.34* #
                黄酮组中的细胞用败酱总黄酮（40 μmol/L）预处理                        败酱总黄酮低剂量组              2.37 ± 0.29 *  1.81 ± 0.23 #△▲
                24 h，败酱总黄酮+白屈菜红碱组细胞用败酱总黄酮                          败酱总黄酮高剂量组              2.40 ± 0.30 *  1.46 ± 0.20 #△
                                                                   败酱总黄酮+白屈菜红碱组           2.42 ± 0.31 *  1.79 ± 0.19 #△▲
               （20 μmol/L）和白屈菜红碱（10 mmol/L）预处理24 h。
                                                                      与假手术组相比，P＜0.05；与模型组相比，P＜0.05；与白屈菜
                                                                                                   #
                                                                                  *
                1.2.9 LDH活性测定
                                                                  红碱组相比，P＜0.05；与败酱总黄酮高剂量组相比，P＜0.05。
                                                                           △
                                                                                                      ▲
                    收集各组海马神经元培养基上清液，取上清液
                20 μL，加入 2，4⁃二硝基苯肼混合均匀后在 37 ℃下                    2.2  各组大鼠海马组织病理学变化
                孵育15 min。然后将NaOH（0.4 mol/L）添加到混合物                     假手术组大鼠海马CA1区细胞形态规则，排列
                中，再在37 ℃下孵育15 min。最后室温放置3 min后                    紧密，未出现明显的病理损伤；模型组大鼠海马CA1
                在酶标仪上测量吸光度值。根据试剂盒说明测定                             区可观察到神经元排列疏松，细胞核固缩深染；与
                LDH活性。                                            模型组相比，败酱总黄酮低、高剂量组大鼠海马组
                1.2.10 流式细胞仪检测海马神经元凋亡                             织上述病理改变减轻，神经元密度增加，且败酱总
                    收集各组海马神经元，使用 70%酒精固定细胞                        黄酮高剂量组对海马组织病理损伤的改善程度优
                24 h，并在 37 ℃下将细胞与Annexin V⁃FITC 和 PI 溶            于败酱总黄酮低剂量组，而白屈菜红碱组海马
                液（各 5 μL）避光孵育 30 min。然后将细胞洗涤并                     CA1 区神经元数量进一步减少；败酱总黄酮+白屈
                重悬于结合缓冲液中，并立即使用流式细胞仪测定                            菜红碱组大鼠海马 CA1 区神经元数量较败酱总黄
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