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第44卷第10期
·1346 · 南 京 医 科 大 学 学 报 2024年10月
有动物实验流程均按照 3R 原则进行。本研究获得 （fasting blood glucose，FBG）测定，使用 HbA1c 检测
南京医科大学附属淮安第一人民医院实验动物伦 仪测定小鼠HbA1c值。
理委员会批准（实验伦理号：DW⁃P⁃2020⁃002⁃01）。 1.2.3 血清生化指标检测
1.1.2 试剂 实验结束后，使用戊巴比妥钠（150 mg/kg）麻醉
替西帕肽、利拉鲁肽（MedChemExpress公司，美 小鼠，摘眼取血，离心机离心获取血清，随后立即将
国）；油 红 O 染 色 试 剂 盒（杭 州 碧 云 天 公 司）； 血清送至南京医科大学附属淮安第一人民医院检
TRIzol TM 、RT⁃PCR 引 物（Invitrogen 公 司 ，美 国）； 验科，使用 Roche Cobas c702 自动生化分析仪检测
HiScript Ⅲ RT SuperMix for qPCR（+gDNA wiper）、 每只小鼠血清中丙氨酸氨基转移酶（alanine amino⁃
ChamQ SYBR qPCR Master Mix（High ROX Premixed） transferase，ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（aspartate
（南京诺唯赞公司）；RNA 保护液、DNase/RNase⁃Free aminotransferase，AST）、总胆固醇（total cholesterol，
Distilled Water、PMSF 溶 液 、5 × DualColor Protein TC）、甘油三酯（triglyceride，TG）、低密度脂蛋白胆固
Loading Buffer（徐州 VicMed 公司）；RIPA 裂解液、肿 醇（low⁃density lipoprotein⁃cholesterol，LDL⁃C）、高密
瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）⁃α抗体、白介 度脂蛋白胆固醇（high⁃density lipoprotein⁃cholesterol，
素（interleukin，IL）⁃1β抗体、IL⁃6 抗体、纤连蛋白 HDL⁃C）含量。
（Fibronectin）抗体、α⁃平滑肌肌动蛋白（α⁃smooth 1.2.4 肝脏苏木素⁃伊红（HE）染色
muscle actin，α⁃SMA）抗体、胶原蛋白Ⅰ（collagen Ⅰ， 小鼠取血结束后，固定小鼠于鼠板上，迅速打
Col⁃Ⅰ）抗体、α⁃微管蛋白（α⁃Tubulin）抗体、丝氨酸/ 开腹腔，分离小鼠肝脏组织，放入冰 PBS 缓冲液中
苏氨酸蛋白激酶B（serine/threonine kinase protein B， 漂洗后，滤纸吸干水分，随后在同一肝叶上剪取横
PKB，又称 Akt）、磷酸化（phosphorylated，p）⁃Akt、磷 截面约 0.5 cm×0.5 cm 大小的组织块，加入 4%多聚
酸烯醇式丙酮酸激酶（phosphoenolpyruvate carboxyki⁃ 甲醛固定 24 h，经乙醇梯度脱水，石蜡包埋后，使用
nase，PEPCK）、葡萄糖⁃6⁃磷酸酶（glucose⁃6⁃phospha⁃ 石蜡切片机切取厚度为 3 μm 的切片。制备好的切
tase，G6Pase）、山羊抗兔二抗、山羊抗鼠二抗（武汉 片经脱蜡、水洗后并用苏木精和伊红进行染色。光
Proteintech 公司）；磷脂酰肌醇 3 激酶（phosphati⁃ 学显微镜观察各组小鼠肝脏组织的病理形态。根
dylinositol 3⁃kinase，PI3K）抗体及 p⁃PI3K 抗体（武汉 据 Kleiner 等 ［16］ 描述的 MAFLD 活性评分（non⁃alco⁃
Abclonal Biotechnology 公司）；PVDF 膜（MiLipore 公 holic steatohepatitis activity score，NAS）对肝损伤进
司，美国）；10%ExpressCast PAGE 彩色凝胶快速试 行半定量评估，包括脂肪变性、小叶炎症以及肝气
剂盒、超敏ECL发光试剂盒（苏州新赛美公司）。 球样变。脂肪变性的分级：0，≤5%；1，>5%~33%；
1.2 方法 2，>33%~66%；3，>66%。小叶炎症的分级（200倍视
1.2.1 动物分组及干预方法 野下）：0，无坏死灶；1，≤2 个坏死灶；2，>2~4 个坏死
实验开始前，小鼠适应性培养 1 周。8 周龄时小 灶；3，>4 个坏死灶。肝细胞气球样变的分级：0，无；
鼠被随机分为 4 组（每组7只）：db/m小鼠组（Control 1，肝细胞少量气球样变；2，肝细胞许多或显著气球
组），db/db小鼠组（Model组），db/db小鼠＋利拉鲁肽 样变。
组（Liraglutide 组），db/db 小鼠＋替西帕肽组（Tirz⁃ 1.2.5 肝脏油红O染色
epatide 组）。每个治疗组分为2笼，每笼饲养 3~4 只 使用20%的蔗糖溶液处理保存在 4%多聚甲醛
小鼠。4 组均在同样环境下饲养。Liraglutide 组和 的肝组织以除去水分，TissueTek OCT 化合物包埋组
Tirzepatide 组小鼠每天分别接受腹腔注射 10 nmol/ 织。随后使用冷冻切片机制备 6 μm 冰冻切片，根据
kg 的利拉鲁肽或替西帕肽持续 10 周。Control组和 油红O染色试剂盒说明书对切片进行染色，同时用苏
Model 组小鼠在同一时间内腹腔注射等量生理盐 木素作为复染剂对细胞核进行染色，显微镜观察。
水。在整个研究期间，每周通过体重秤测量小鼠体 1.2.6 Western blot检测
重，随后根据小鼠的体重变化调整药物剂量。 50 mg肝组织样品加入RIPA裂解液及PMSF进
1.2.2 血糖及糖化血红蛋白（glycated haemoglobin 行匀浆，匀浆后提取总蛋白，使用BCA测定法测量样
A1c，HbA1c）检测 品中的蛋白质浓度，蛋白样品与上样缓冲液按照1∶5
实验结束后，所有动物禁食不禁水12 h，尾静脉 的比例充分混匀，100 ℃煮沸变性10 min。采用十二
采血，使用血糖仪及配套血糖试纸进行空腹血糖 烷基硫酸钠⁃聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS⁃PAGE），
