Page 20 - 南京医科大学自然版
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第44卷第11期
               ·1486 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年11月


              心管中，350 g 离心 5 min，吸弃上清。加入 1 mL 胰                 化，即氧浓度约 1%时开始计时，2 h 后取出细胞，更
              酶抑制剂，350 g离心5 min，弃上清。加入预热的无                      换为正常培养基，继续培养。
              血清培养基1 mL，用1 mL无菌枪头温和均匀地吹打                        1.2.9  体外神经干细胞增殖能力检测
              至单细胞悬液。在培养初期，培养基采用无血清培                                 加入含有 10 μmol/L BrdU 的 SFM 培养基，置于
              养基（serum⁃free medium，SFM），每隔 2 d 进行半量             37 ℃、5% CO2培养箱中培养24 h，吸除培养基，500 μL
              换液。在 7 d 左右，神经干细胞可形成神经球，将                         PBS 漂洗 5 min 3 次，4%多聚甲醛固定 20 min 后，
              神经球转移到新的无菌6 cm培养皿中继续培养。将                          PBS再次漂洗5 min 3次。加入含有0.5%的Triton X⁃100

              第 3 代神经球消化成单细胞悬液，调整密度为 1×                         的 PBS 溶液室温下通透 10 min，吸除通透液，加入
              10 个/mL，接种至多聚赖氨酸（100 μg/mL）和层黏连                   PBS 漂洗 3 次。向每孔中加入 2 mol/L 的盐酸溶液，
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              蛋白（0.25 μg/mL）等比例混合液预处理的24孔板中，                    于 37 ℃培养箱中孵育 30 min 进行 DNA 变性。PBS
              37 ℃、5% CO2培养。约2 h后神经干细胞开始贴壁。                     漂洗 5 min 3 次，加入山羊血清，室温封闭 1 h 后，加
              2~3 d后，贴壁神经干细胞长满培养皿开始细胞传代。                        入 BrdU 抗体（1∶1 000），4 ℃孵育过夜。吸除一抗，
              1.2.7 Nestin免疫荧光染色检测成体神经干细胞干性                     用PBST溶液于摇床上漂洗5 min 3次。在避光条件
                  取培养至第 3 代的干细胞，调整细胞的密度为                        下加入荧光二抗，室温避光孵育 1 h。吸除二抗，于
              1×10 个/mL 。接种于铺有多聚赖氨酸和层黏连蛋                        避光条件下用 PBST 溶液于摇床上漂洗 5 min 3 次。
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              白双包被的无菌玻片的24孔板中，继续培养约8 h。                         荧光显微镜下观察、拍照，计算 BrdU 阳性细胞占总

              待成体神经干细胞爬片后，吸除SFM培养基。用pH                          细胞的比例。
              为7.4的无菌PBS缓冲液洗涤3次，5 min/次。4 ℃预                    1.3  统计学方法
              冷的多聚甲醛室温下固定 30 min，无菌 PBS 置于                           所有数据均使用 GraphPad 软件分析。定量资
              摇床上洗涤 3 次，每次 5 min。2 mol/L 的 HCl 溶液               料数据以均数±标准误（x ± sx ）表示，两组数据的比
              室温孵育 35 min，吸除 HCl 溶液，加入 pH 为 8.5 的               较采用双尾非配对Student’s t检验分析。小鼠的行
              0.1 mol/L硼酸钠溶液，中和10 min。无菌PBS置于摇                  为学评分对比图采用箱线图展示。P < 0.05为差异
              床上洗涤 3 次，每次5 min。加入0.5%的Triton X⁃100              有统计学意义。
              通透 5 min。吸除通透液，加入 5%的即用型山羊血
                                                                2 结     果
              清，室温下，放置于摇床上，封闭 1 h。除去山羊血
              清，加入小鼠抗Nestin一抗（1∶500 稀释），先在37 ℃                  2.1  成功完成 mfat⁃1 小鼠基因型鉴定并构建 HIBD
              孵育1 h，再放入4 ℃恒温摇床孵育过夜。吸除一抗，                        模型
              用无菌PBST置于摇床上洗涤3 次，每次10 min。避                           凝胶电泳结果显示，泳道6~10出现438 bp的阳
              光加入 Alexa Fluor 488 标记的羊抗鼠二抗（1∶200                性基因片段（图 1A），是 mfat⁃1 转基因阳性的小鼠。
              稀释），摇床上室温孵育 1 h。吸除二抗，用无菌                          通过结扎左侧颈总动脉（图 1B）和 8%的低氧进行
              PBST 置于摇床上洗涤3 次，每次5 min，避光。加入                     HIBD造模后，WT小鼠出现偏瘫（图1C）、提尾转圈、
              DAPI核染2 min，暗室中荧光显微镜观察并拍照。                        精神不振、腹部凹陷等表现，表明造模成功，此时小
              1.2.8  神经干细胞氧糖剥夺/复氧（oxygen⁃glucose                鼠脑部出现梗死区。
              deprivation/reoxygenation，OGD/R）实验                2.2  mfat⁃1小鼠行为学改善且脑梗死体积减小
                  将生长状态良好的神经球转移至15 mL离心管                             用 经 典 的 Longa 评 分 和 Bederson 评 分 评 估
              中，200 g离心5 min。吸除上清液，加入0.3 mL预热                   HIBD 造模后 24 h 小鼠的神经功能缺损和神经行为
              的Accutase消化酶，轻微吹打神经球，使其与消化酶                       表现。如图 2A 所示，作为对照的假手术组中的所
              充分混合。将加入酶的细胞悬液置于 37 ℃的热台                          有小鼠的神经行为评分等级均为 0 级，显示其神经

              上，消化 2~3 min，500 g 离心 5 min。吸除 Accutase           功能并未缺损。而在 HIBD 造模组中，mfat⁃1 小鼠
              消化液，加入 1 mL SFM 重悬神经干细胞，用微量移                      的 Longa 评分较野生型低（2.05±0.69 vs. 3.35±0.75，
              液枪温和吹打 60~80 次，使神经球分散为单细胞悬                        P < 0.01），mfat⁃1组有更好的行为学表现，显示出较
              液。将细胞放于37 ℃培养箱中平衡30 min，培养基                       弱的神经损伤。图 2B 中的 Bederson 评分也展示了
              更换为无糖培养基。乏氧袋、细胞连同氧气指示剂                            相同的结果（WT+HIBD 组 2.55±0.60 vs. mfat⁃1+
              一起放入密闭的盒子中，待氧气指示剂颜色发生变                            HIBD组1.35±0.59，P < 0.01）。以上结果表明，mfat⁃1
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