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第44卷第11期 刘雨桐，张 何，蔡皓然，等. mfat⁃1转基因小鼠通过促进神经干细胞增殖修复缺氧缺血性脑损伤［J］.
2024年11月 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（11）：1483-1490 ·1485 ·

1.2.2 HIBD小鼠模型的建立 瘫痪侧倾倒，重度神经功能缺损；4 分，不能自发行
手术缺血建模：采用改良的Rice⁃Vannucci模型 走，有意识丧失。
建立方法，使用 2%异氟烷麻醉小鼠。使用剃毛刀 Bederson 评分具体操作为：小鼠尾巴被轻轻握
将其颈部毛发削除。酒精棉球进行常规消毒后，使 住，悬在地板上方1 m处，观察前肢弯曲情况。评估
用手术刀在颈正中距离下颌线1 cm处作一长约1 cm 标准分为 4 个等级：0 级，无明显缺陷；1 级，前肢屈
的切口。在体视显微镜下用眼科镊钝性逐步分离 曲；2级，对侧推力（和前肢屈伸）的抵抗力降低而无
皮下组织及颈前肌群，暴露气管前肌后沿左侧胸锁 盘旋；3级，行为与2级相同，提尾转圈。
乳突肌肌腱向下分离可见左侧的颈动脉三角，其内 1.2.5 小鼠体内干细胞增殖水平检测
可见搏动的颈总动脉及其伴行的静脉和神经。用 灭菌生理盐水溶液作为溶剂配制BrdU溶液（母
眼科镊小心分离左侧颈总动脉避免损伤附近的迷 液浓度为15 mg/mL）。断颈处死前2 h按照300 mg/kg
走神经，以免影响小鼠的正常呼吸从而导致死亡。 体重的标准进行腹腔注射。灌注过的脑组织置于
如有少量渗血，可用棉签压迫出血处10 s即可止血， 4%多聚甲醛中固定24 h，经脱水、透明、浸蜡以及包
分离颈总动脉后用6⁃0缝合线双重结扎，并在两个结 埋制作成组织蜡块，选取小鼠大脑的 SVZ 区和 SGZ
扎线结中间用维纳斯剪剪断血管。剪去多余的缝合 区进行冠状面切片，对切片进行常规脱蜡，ddH2O清
线，保持视野洁净。最后用持针器缝合皮肤切口。每 洗2次，每次3 min。将石蜡切片放入含有抗原修复
只小鼠手术总时间控制在5 min左右。假手术组仅暴 液的烧杯中，121 ℃、3 min进行抗原修复。在组织上
露和分离左侧颈总动脉，既不结扎也不剪断血管。 滴加 2 mol/L 盐酸 37 ℃孵育 30 min。弃掉盐酸，用
缺氧建模：术后 1 h，小鼠苏醒后将 HIBD 组放 PBS 清洗3次，每次10 min。滴加即用型山羊血清室
入密闭的低氧舱中。低氧舱中持续通入92%氮气， 温封闭1 h，移除封闭液，加入BrdU抗体，4 ℃孵育过
气体流量控制在 2 L/min，使舱内氧气浓度保持为 夜。除去一抗，用PBST清洗切片3次，每次5 min。滴加
8% 。 缺 氧 过 程 持 续 50 min，保 持 舱 体 温 度 为 荧光二抗，孵育1 h。PBST清洗3次，每次5 min，DAPI
37 ℃。缺氧过程中小鼠会出现皮肤青紫，烦躁不 核染3 min并封片，在荧光显微镜下拍照并计数。
安，间歇性全身癫痫，翻身困难，浅快呼吸、昏迷甚 1.2.6 成体神经干细胞体外培养系统的建立
至死亡。假手术组则不做缺氧处理。 取8~12周龄的mfat⁃1转基因小鼠及其同窝WT
1.2.3 TTC染色检测大脑梗死体积 小鼠，通过断颈法处死小鼠，经 3%碘酒浸泡 3 min，
小鼠深度麻醉后迅速断头取全脑，吸水纸吸干 75%酒精漂洗、消毒后，转移至 PBS 中浸泡冲洗
脑表面液体，置于-40 ℃冰箱内冷冻 10 min。将冷 1遍。取无菌剪刀剪去颅骨上的毛发、皮肤，剪开颅
冻后的大脑组织平放于-20 ℃冷冻台上，用预冷的 骨，仔细剥除脑膜、血管及纤维结缔组织成分，用挖
刀片冠状位切脑片，整个大脑半球（含嗅球）被切成 脑勺剥离完整的鼠脑。将剥离的完整鼠脑转移至
5~6片后放于干燥的皿内，每片厚度约2 mm。皿内 6 cm 无菌的培养皿中，用预冷的 PBS 清洗 2 遍。然
加入一定体积的2% TTC溶液，以浸没脑片为宜，放 后转移至新的6 cm无菌的培养皿中，用无菌刀片对
入 37 ℃温箱内，避光孵育 15 min 后将脑片翻面，相 鼠脑进行冠状切片。将鼠脑侧脑室室脑膜下区所
同条件下继续孵育 15 min。吸除皿内的 TTC 溶液， 在的冠状切片用无菌镊子转移至新的 6 cm 无菌的
加入适量 4%多聚甲醛过夜固定组织。拍照，观察 培养皿中，移入超净台，加入少量预冷的 0.01 mol/L
脑切片颜色（大脑梗死的组织内，脱氢酶活性消失， DPBS。将上一步获得的鼠脑冠状切片移至体视显
不能将 TTC 染色液还原成红色，故呈现苍白色；而 微镜下，用无菌眼科显微镊分离侧脑室室脑膜下区
有活性的脑组织中含有脱氢酶，可以使TTC还原成红 的脑组织。将上一步分离获得的侧脑室室脑膜下
色，故呈现红色）。使用Image J软件计算梗死体积。 区的脑组织转移至无菌的1.5 mL离心管中，加入预
1.2.4 小鼠行为学评分 热的0.1%的胰酶200 μL，用无菌剪刀在超净台上充
Longa 评分具体操作为：将小鼠摆放在地板上， 分剪碎，直至脑组织块大小为1.0 mm左右。将剪碎
观察小鼠行走能力。评分标准分为 5 个等级：0 分， 的脑组织块转移至6孔板中，加入预热的0.1%的胰
正常，无神经功能缺损；1 分，对侧前爪不能完全伸 酶1 mL，37 ℃培养箱中消化30 min。每隔10 min取
展，轻度神经功能缺损；2分，行走时，小鼠向瘫痪侧 出用巴士德管轻柔吹打 1 次，显微镜下观察组织消
转圈，中度神经功能缺损；3分，行走时，小鼠身体向 化情况。将消化好的脑组织块移入无菌的15 mL离