Page 18 - 南京医科大学自然版
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第44卷第11期
               ·1484 ·                           南 京    医 科 大 学 学         报                        2024年11月


                  缺氧缺血性脑损伤（hypoxic ischemic brain dam⁃          京医科大学动物实验中心饲养，实验过程中严格遵
              age，HIBD）是指脑血流减少或停止，导致脑组织部                        守南京医科大学动物伦理委员会的规定（伦理学批
                           ［1］
              分或完全缺氧 。由于高代谢需求，大脑易受到血                            文编号：IACUC⁃2012032）；Accutase 细胞消化液、
              液供应剥夺的损害。神经元损伤和不可修复的脑                             DMEM/F⁃12 培养基、B⁃27 添加剂、杜氏磷酸盐缓冲
              组织损伤在脑缺血后的几分钟内即可发生                     ［2-3］ 。新   液（DPBS）、无糖 DMEM（Gibco 公司，美国）；碱性成
              生儿和成年人的脑缺氧缺血损伤可导致严重的神                             纤维细胞生长因子、表皮生长因子、肝素、黄体酮、
              经功能障碍或死亡 。HIBD 已成为最严重的公共                          腐胺、HEPES 缓冲液、葡萄糖、多聚赖氨酸（D 型，
                               ［4］
              卫生问题之一。虽然近年来对HIBD的研究越来越                           L 型）、5⁃溴脱氧尿嘧啶核苷（BrdU）、4%多聚甲醛、
              深入，但迄今还没有用于治疗 HIBD 的药物获得食                         4’，6⁃二脒基⁃2⁃苯基吲哚（DAPI）、氯化三苯基四氮
                                   ［5］
              品及药物管理局的批准 ，因此，目前迫切需要探索                           唑（2，3，5⁃triphenyl⁃2H⁃tetrazolium chloride，TTC）试
              新的治疗策略。                                           剂（Sigma 公司，美国）；胰岛素铁硒传递蛋白（ITSS）

                  饮食中 n⁃3 多不饱和脂肪酸（n⁃3 polyunsaturat⁃           （Invitrogen公司，美国）；台盼蓝染液PI Staining Solu⁃
              ed fatty acid，n⁃3 PUFA）在防治 HIBD 中发挥的有益            tion（Thermo Fisher Scientific 公司，美国）；BrdU 抗体
              作用已有广泛研究，包括抑制炎症反应和氧化应                            （Abcam 公司，美国）；层黏连蛋白（Roche 公司，瑞
              激、促进脑血管新生、减少细胞凋亡以及改善代谢                            士）；细胞冻存液（苏州新赛美生物科技有限公司）；
              等 ［6-8］ 。在哺乳动物中，因为缺少有效的合成酶，n⁃3                    10%即用型正常山羊血清（武汉博士德公司）；苏木
              PUFA 在血浆中的含量与摄入量直接相关，并且受                          素染液、伊红染液（武汉谷歌生物公司）；无水乙醇
              到吸收率的影响，因此本研究利用稳定表达内源性                           （上海沪试公司）；2×Taq Master Mix（南京诺唯赞公
              n⁃3 PUFA的mfat⁃1转基因小鼠开展相关研究。fat⁃1                  司）；核酸染料（武汉 ABclonal 公司）；引物序列和
              基因来源于秀丽隐杆线虫，编码n⁃3去饱和酶，可以将                         磷酸化的寡核苷酸序列由南京金斯瑞公司合成；
              n⁃6 PUFA 转化为 n⁃3 PUFA，提高内源性 n⁃3 PUFA/             PBST 溶液、Triton X⁃100（AMRESCO，美国）；盐酸溶
              n⁃6 PUFA的比值。mfat⁃1转基因小鼠是将fat⁃1基因                  液、荧光二抗、石蜡、二甲苯、Tris、EDTA、乙醇、琼脂
              的密码子进行了优化，使其在哺乳动物体内可以进                            糖（上海英潍捷基公司）。
              行更加高效的表达。n⁃3 PUFA在大脑中的高表达对                        1.2  方法
              HIBD诱导的脑损伤具有一定保护作用，可以导致相                          1.2.1  琼脂糖凝胶电泳鉴定mfat⁃1转基因小鼠的基
              对较低水平的神经元坏死、凋亡和炎症                 ［9-10］ 。        因型
                  成年啮齿类动物大脑内有两个特定区域可以                                将 mfat⁃1 转基因小鼠与 C57BL/6J WT 小鼠交
              持续进行成体神经发生：侧脑室的脑室下区（sub⁃                          配繁殖得到子代小鼠。将用于小鼠编号的脚趾剪
              ventricular zone，SVZ）和海马齿状回的颗粒层下区                 碎后放入无菌EP管内，加入400 μL裂解液和2.5 μL
             （subgranular zone，SGZ） 。已有研究显示，在脑损                 蛋白酶 K（20 mg/mL）后混匀，55 ℃水浴裂解过夜。
                                   ［11］
              伤之后，SVZ 和 SGZ 区域存在短暂但是明显的神经                       向 EP 管内加入等体积的酚/氯仿，涡旋 10~15 s，室
              干细胞（neural stem cell，NSC）增殖，以及向同侧的                温静置 3 min。12 000 r/min 离心，吸取上层无色水
              受损部位迁移、修复的现象             ［12-13］ 。但是这一自发过         相液体 200 μL 于新的 EP 管内。加入 2 倍体积预冷
              程远不足以修复卒中后的大脑损伤，因此科研人员                            的无水乙醇，涡旋混匀后，12 000 r/min 离心 5 min。
              将研究重点转向如何促进内源性神经干细胞增殖                             弃上清，沿管壁加入 70%乙醇清洗，重复以上步
              和分化。本研究首次从促进内源性成体神经干细                             骤。再将 EP 管倒扣于吸水纸上，吸干乙醇，加入
              胞增殖的角度来探讨 mfat⁃1 转基因小鼠对 HIBD 的                    65 ℃预热的无菌ddH2O溶解DNA，分光光度计检测
              修复作用，为HIBD的治疗提供新的思路和方向。                           DNA 的浓度与纯度。利用 NCBI 网站（https：//www.
                                                                ncbi.nlm.nih.gov/）设计靶向mfat⁃1基因序列的引物，
              1 材料和方法
                                                                产物大小为438 bp，其中正向引物序列为5′⁃GGACCTT⁃
              1.1  材料                                           GGTGAAGAGCCG⁃3′，反向引物序列为5′⁃GCCGTC⁃
                  野生型（wild type，WT）C57BL/6J 小鼠，由南京              GCAGAAGCCAAAC⁃3′ 。 将 PCR 产 物 进 行 1% 琼
              医科大学医药实验动物中心提供。C57BL/6J 背景                        脂糖凝胶电泳（120 V，45 min），使用凝胶成像
              的 mfat⁃1 转基因小鼠以及同窝阴性对照小鼠，由南                       仪曝光。
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