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第44卷第11期 王嘉桐，徐圣杰，李 姗，等. 成纤维细胞中赖氨酰氧化酶调控卵巢癌紫杉醇敏感性的作用
2024年11月 及机制探讨［J］. 南京医科大学学报（自然科学版），2024，44（11）：1499-1509 ·1501 ·

（武汉赛维尔生物科技有限公司）。兔单克隆抗 CUGACGACAACCCUUAUUATT ⁃ 3′ ；siLOX ⁃ 2 反 义
LOX 抗体、小鼠单克隆抗α⁃SMA 抗体（Abcam 公司， 链：5′⁃UAAUAAGGGUUGUCGUCAGTT⁃3′。
美国）。小鼠单克隆抗LOX抗体、小鼠单克隆抗Vi⁃ 1.2.4 蛋白提取及Western blot
mentin 抗体（Santa Cruz Biotechnology 公司，美国）。 用不同浓度（100、200 μg/mL）的CBP处理人源成
荧光酶标记的抗鼠 IgG（Cell Signaling Technology 公 纤维细胞48 h后，或者用不同浓度（5、50、100、250、
司，美国）。 500 ng/mL）的PTX处理人源成纤维细胞及小鼠成纤
1.1.3 仪器 维细胞（L929）48 h 后，收集细胞加入 RIPA 裂解

多色荧光/化学发光成像分析系统（ProteinSim⁃ 液提取蛋白样品，行 SDS⁃PAGE 后将蛋白转移至
ple 公司，美国）。正置光学显微镜（Zeiss 公司，德 PVDF 膜上，用含 5%脱脂奶粉的 TBST 封闭 1 h 后，

国）。激光共聚焦显微镜（Leica公司，德国）。Synergy 与β⁃actin、GAPDH 抗体4 ℃孵育过夜。次日将膜与
H4 Hybrid 酶标仪（BIO⁃TEK公司，美国）。 对应种属的二抗室温孵育 1 h 后，用 ECL 显影剂显

1.2 方法 影后化学发光成像分析系统拍照。以β⁃actin 及
1.2.1 生物信息学分析 GAPDH作为内参，使用Image J进行定量分析。

使用TISCH2数据库（http：//tisch.comp⁃genomics. 1.2.5 RNA提取与qRT⁃PCR分析
org/）分析不同单细胞测序数据中LOX基因在卵巢癌 收集PTX处理的细胞及siRNA转染的人源成纤
中的表达特征，获得LOX表达水平高的细胞群体。 维细胞，用 RNA 提取纯化试剂盒提取及纯化细胞
1.2.2 细胞培养 总 RNA，并使用逆转录试剂盒将细胞总 RNA 逆转
A2780、L929 及人源成纤维细胞培养于含有 录 成 cDNA。 之 后 ，加 入 SYBR qRT ⁃ PCR Master
10%胎牛血清和 1%青链霉素的 DMEM 高糖培养基 Mix，用 ViiA 7 实时荧光定量 PCR 系统（Life tech⁃
中，OV⁃CAR3 培养于含有 20%胎牛血清和 1%青链 nologies）行 qRT⁃PCR。以 β⁃actin 或 GAPDH 为内
霉素的RPMI⁃1640培养液中，所有细胞均在37 ℃恒 参，采用 2 -ΔΔCT 方法计算 LOX 在细胞内的相对表达。
温、含5% CO2的细胞培养箱中培养。 引物序列见表1。
1.2.3 细胞转染 1.2.6 转录组测序
在 6 孔板中培养人源成纤维细胞，当细胞融合 转录组测序由上海美吉生物医药科技有限公
度到达约70%时，按照Lipofectamine 3000 试剂说明 司完成。步骤为：收集瞬时转染 siRNA（si⁃Ctrl、si⁃
书转染siRNA。转染 6 h 后，PBS 清洗 3 次，更换为无 LOX⁃1）24 h 的人源成纤维细胞，提取总 RNA，利用
双抗的培养基；转染 24 h 后，收集细胞进行后续实 带有 Oligo（dT）的磁珠与 ployA 进行 A⁃T 碱基配对，
验 。 siCtrl 正 义 链 ：5′ ⁃ UUCUCCGAACGUGUCAC⁃ 分 离 含 有 Oligo（dT）的 mRNA；加 入 fragmentation
GUTT⁃3′；siCtrl 反义链：5′⁃ACGUGACACGUUCGG⁃ buffer，将 mRNA 随机断裂成 300 bp；在逆转录酶的
AGAATT⁃3′；siLOX⁃1 正义链：5′⁃GCACAGUUGU⁃ 作用下，利用随机引物，以 mRNA 为模板反转合成
CAUCAACAUTT⁃3′；siLOX⁃1 反义链：5′⁃AUGUUG⁃ cDNA，随后进行第二链合成，形成稳定的双链结构；
AUGACAACUGUGCTT ⁃ 3′ ；siLOX ⁃ 2 正 义 链 ：5′ ⁃ 将双链 cDNA 的黏性末端加入 End Repair Mix 将其

表1 引物序列
Table 1 Primer sequences
Gene Organism Forward（5′→3′） Reverse（5′→3′）
Lox Mus musculus CCTGGCCAGTTCAGCATATAG GTAAGAAGTCCGATGTCCCTTG
LOX Homo sapiens TACCCAGCCGACCAAGATA TGGCATCAAGCAGGTCATAG
β⁃actin Mus musculus CAGCCTTCCTTCTTGGGTATG GCATAGAGGTCTTTACGGATG
β⁃ACTIN Homo sapiens AAGGCCAACCGCGAGAAG ACAGCCTGGATAGCAACGTACA
GAPDH Homo sapiens ATTCCACCCATGGCAAATTCC GACTCCACGACGTACTCAGC
CD34 Homo sapiens AATCAGCACAGTGTTCACCAC TGCCCTGAGTCAATTTCACTTC
CLDN2 Homo sapiens GCCTCTGGATGGAATGTGCC GCTACCGCCACTCTGTCTTTG
ITGAV Homo sapiens ATCTGTGAGGTCGAAACAGGA TGGAGCATACTCAACAGTCTTTG
PTPRF Homo sapiens GCTTCGAGGTCATTGAGTTTGA CCCATGTCGATGGAAGGGAA